《Current Opinion in Structural Biology》：Closing the loop: Experimentally validated methods in artificial intelligence–driven protein design
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这篇综述系统性地阐述了人工智能（AI）驱动蛋白质设计的端到端全流程，涵盖数据、模型、候选生成筛选与实验验证。文章以成功经过实验验证的方法为核心，重点评述了其在结合剂（Binder）、抗体（Antibody）和酶（Enzyme）三大应用领域取得的进展与挑战，并强调了实验反馈对推动该领域发展的持续关键作用。
人工智能驱动的蛋白质设计：从数据、模型到部署的完整闭环
引言
设计具有特定生物功能的蛋白质，即蛋白质设计，长期以来是分子与合成生物学的核心目标。传统的计算方法依赖于物理模拟、经验特征或专家启发性规则，通常计算成本高、难以扩展，并且受限于高质量结构信息的需求。近年来，人工智能（AI）的进展通过使模型能够从大规模生物数据中直接学习序列-结构-功能关系，开始绕过许多这些限制，为预测和生成可能执行所需功能的序列提供了一条可扩展的路径。
人工智能驱动蛋白质设计的端到端管线：数据、模型、部署
AI驱动的蛋白质设计作为一个包含关键阶段的管线运行：数据集构建、模型训练、样本生成与筛选，以及实验验证。蛋白质由氨基酸序列及其对应的三维（3D）结构组成。基于结构的AI指导蛋白质设计利用在蛋白质结构上训练的模型。这些工作流程通常从骨架设计模型开始，生成预期支持特定功能的候选骨架几何结构。一旦生成骨架，就使用固定骨架序列设计模型来预测可能折叠成该结构的氨基酸序列。最后，使用结构预测模型评估生成的序列是否可能折叠成预期结构，以筛选出不一致的设计。然而，这远非唯一可行的方法。许多模型将骨架生成和序列设计统一起来，共同生成结构和序列，而其他模型则通过结构预测模型进行反向传播，以生成满足生物和物理约束的蛋白质。相比之下，基于序列的蛋白质设计模型则完全放弃结构，其前提是蛋白质序列数据包含足够的信息来设计功能性蛋白质。基于序列的模型可以预测稳定突变、重新设计大区域并生成完整序列。
蛋白质设计模型可以无条件地生成蛋白质，也可以基于输入的设计规范有条件地生成。在条件生成设置中，有关目标蛋白质或靶标的信息在生成前提供给模型。基于结构的模型通常以域和结构的形式接收上下文，设计的蛋白质应与之相互作用或包含这些结构。相反，基于序列的模型以部分蛋白质序列、同源比对或未比对的同源序列为条件。基于序列的模型还可以针对特定家族酶的样本集或分布进行微调，以生成相关蛋白质。
AI驱动蛋白质设计的最后阶段是对候选设计进行实验验证，测试模型生成的蛋白质是否表达、按预期折叠并执行指定功能。尽管受时间和成本的内在限制，实验是必不可少的。一些研究直接评估模型产生可行设计的能力，无需额外筛选。更常见的是，经过计算机筛选后选择实验候选物。典型步骤包括丢弃未能通过结构预测或置信度阈值的序列，使用Rosetta或相关基于物理的分数进行排序或过滤以去除能量不利或非物理的结构，进行聚类以保持序列或结构多样性，以及人工检查。
模型被确定产生功能性蛋白质的速度取决于所进行实验的类型、规模和成功定义，这些因应用而异。所有结构化蛋白质共有的三种实验检测方法（按分辨率递增和通量递减排序）是：表达、二级结构表征和3D结构确定。表达通常在基于细胞的系统中评估，并使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）确认正确大小，使用尺寸排阻色谱（SEC）确认单分散性和不存在聚集或多聚化。二级结构通常用圆二色性（CD）评估。由于CD提供详细的机制信息，它常被用作快速替代，或在更昂贵的原子分辨率方法（如X射线晶体学XRC和电子显微镜EM）之前使用。
应用领域：结合剂、抗体和酶
目前，三个蛋白质设计应用因其影响力和可证明的成功而脱颖而出：结合剂、抗体和酶。以下部分概述了各自的重要性，并强调了AI驱动蛋白质设计管线的各个阶段在应用于这三个领域时的细微差别。
结合剂
结合剂是能与另一种蛋白质、小分子或核酸形成强特异性分子间接触的蛋白质。按需设计定制结合剂的能力，通过控制蛋白质-蛋白质和蛋白质-配体相互作用，实现了对生物系统的精确调控。已展示的应用包括设计用于抑制蛇毒或病毒蛋白的结合剂、针对特定细胞的免疫疗法，以及针对内在无序蛋白质设计的结合剂。
为了设计功能性结合剂，模型必须捕捉蛋白质如何与目标表面相互作用，并利用此上下文生成兼容的界面。蛋白质结合剂的设计得益于蛋白质数据库（PDB）中的相互作用结构。一种常见的训练设置涉及屏蔽复合物中的一条链并预测其序列和结构，从而有效地将结合剂设计构建为条件生成任务。其他策略包括学习用于几何匹配的表面指纹图谱以及语言建模。尽管结合剂设计传统上被视为基于结构的任务，但语言建模已显示出强大的性能。一个可能的解释是，语言模型从共进化信号中隐式地学习了结构特征，当以相互作用蛋白质为条件或进行微调时，能够捕捉结合所需的关系。尽管在蛋白质-配体结合剂设计方面取得了实质性进展，但成功率仍然低于蛋白质-蛋白质结合剂，这可能是由于当前数据集中小分子的代表性相对有限。
结合剂功效通常通过解离常数（Kd）来量化，即一半结合剂与配体结合时的配体浓度，使用表面等离子体共振（SPR）、生物层干涉术（BLI）和酵母表面展示（YSD）等动力学检测方法测量。理想情况下，为了确认预测的结合相互作用，使用XRC或冷冻电镜（CryoEM）来获得结合复合物的结构。在实践中，这已针对与流感血凝素（HA）、过敏原DerF7和DerF21、SpCas9、与癌症和细菌靶标MCL1、GABARAP和RbtA的环状结合剂以及与小分子的结合剂完成。在验证模型时，通常会针对多种靶标设计和测试候选结合剂，以评估模型的通用性。目前，常见的靶标是PD-1、PD-L1、IL-7RA、TrkA和TNF-α。许多这些靶标的成功率已远超过10%，但TNF-α除外，目前只有Chai-2模型能够成功创建针对它的结合剂。
虽然这些结果标志着实质性进展，但重要的是要注意，成功率通常指的是体外的结合，通常是在细胞环境或动物模型之外。需要进一步进展以评估体内结合强度和特异性，并优化属性以实现最终的实际部署。一个关键挑战是最大化靶向结合与非靶向结合的比例，特别是在复杂的生物环境中，非预期的相互作用可能导致毒性或疗效丧失。相反，设计能够作用于多个靶标的结合剂是另一个重要但困难的目标。最后，对于治疗应用，最大限度地降低免疫原性仍然是一个核心问题。
抗体
抗体的核心功能是识别外来分子和病原体，并介导其清除和中和。与通用结合剂不同，抗体具有保守的免疫球蛋白框架，该框架不仅决定了其结构构架，还决定了结合事件如何通过恒定区（Fc region）与免疫效应功能相耦合。抗体因其良好的安全性、成熟的优化流程和可扩展的生产基础设施而备受追捧。除了直接治疗用途外，它们还支持分子检测和成像、嵌合抗原受体（CAR）-T细胞中的识别域以及双特异性和抗体-药物偶联物平台中的支架等应用。
抗体设计的核心挑战在于PDB中抗体结构的覆盖范围有限，尽管诸如SAbDab等专用资源汇集了几乎所有已知的抗体结构和复合物。补充性的以序列为重点的存储库，如Observed Antibody Space和AbRank，汇集了数亿个抗体库序列和数十万个结合测量值，但仅为其中一小部分序列提供原子分辨率结构。形成抗原结合位点的互补决定区（CDR）由V(D)J重组和随后的体细胞超突变产生，这产生了极端的序列和结构多样性，尤其是在CDR H3区域。因此，个体抗体很少位于深度同源家族中，支持基于多序列比对（MSA）模型的共进化信号是稀疏的。解决这些问题需要利用抗体特异性序列统计数据和结构先验的建模策略。
治疗性抗体开发涉及并行优化多个目标，包括结合亲和力、特异性、选择性和可开发性。AI驱动的蛋白质设计有望完全在计算机中执行这两个步骤，并额外实现了结合表位（epitope）的指定。虽然早期模型专注于重新设计CDR环以增强亲和力或适应新抗原，但最近经过实验验证的模型已成功设计了完整的抗体和纳米抗体，在多个靶标上实现了亚纳摩尔级亲和力和两位数的成功率。其中一些模型还支持框架区工程、亲和力成熟和人性化，进一步简化了设计活动。这些最新模型的关键突破在于通过引入生物先验到生成过程中，例如引入自定义损失函数，激励非结构化的CDR环，而不是许多基于结构的扩散模型中常见的α螺旋。
虽然许多可开发性指标都有专门的生物物理或生化检测方法，但抗体与抗原结合的强度反映在Kd上，测量方法与其它结合剂类似，包括SPR、BLI和YSD。同样，由于共享的检测方法、数据限制和部署标准，抗体设计也面临类似的局限性。
酶
酶催化异常广泛的化学反应，使其成为蛋白质设计的重要目标。例如，它们可以合成传统化学方法难以或不切实际生产的分子，降解塑料等顽固材料，并通过CRISPR相关核酸酶等系统实现精确的基因组编辑。
酶设计带来了独特的挑战，因为它不仅需要对蛋白质本身进行建模，还需要对其催化的化学反应进行建模。这包括表示底物以及稳定过渡态所需的活性位点的几何结构和静电特性。因为催化涉及瞬态的高能中间体，这些信息可能难以仅从静态结构中推断，可能需要用其他数据源或机制先验进行增强。
此外，这个问题跨越多个难度级别：生成催化已知反应的酶的变体比设计用于自然界未观察到的反应的酶更容易。目前的能力主要集中在前者。基于序列的方法已被用于在缺乏结构信息的情况下生成功能性Cas9、磷酸丙糖异构酶和碳酸酐酶变体。早期的基于结构的策略使用幻觉方法或围绕从已知酶中提取的催化残基进行骨架扩散。后一种方法固定了催化侧链的方向，限制了活性位点的灵活性并减少了设计范围。最近的模型通过学习最佳的催化残基放置来解决这个问题，允许构建更通用的活性位点几何结构。这一进展代表了向实现具有任意机制的酶设计迈出的一步，因为这些模型与使用密度泛函理论（DFT）建模的活性位点兼容。
酶的实验验证标准化程度低于结合剂和抗体，因为大多数底物需要不同的检测方法。扩大酶验证规模需要将催化活性转化为可测量信号的检测方法。例如，许多模型通过设计产生荧光产物的酶来验证，而其他模型则设计了可以通过测序验证其活性的核酸酶。
AI驱动的酶设计始于成功生成特征明确的酶类，并已开始专注于为其他催化机制设计酶。目前，可用AI工具设计的反应范围仅为可能范围的一小部分。弥补这一差距可能需要超越纯粹的数据驱动方法，可能受益于整合基于物理的方法，如量子力学和分子力学、密度泛函理论或分子动力学代理。
讨论
在实现准确结构预测成为可能之后的短短几年内，蛋白质设计已经发展到AI模型能够生成具有可测量实验成功率的结合剂、抗体和酶的程度。这些模型涵盖了一系列方法，包括基于序列的语言建模、结构条件扩散以及通过可微分结构预测器进行迭代优化。尽管方法多样，但它们共同的基础在于定义AI模型学习的经验景观的数十年间精心策划的实验数据的质量和广度。
实验检测在确定AI模型针对哪些功能和属性进行优化方面起着核心作用。结合检测的可扩展性和可及性使得结合剂和抗体设计取得了快速进展，成功率不断提高，结构多样性日益增长。相比之下，小分子环境、脱靶特异性、人性化和可开发性等属性，由于其复杂性和相应测量的成本，数据仍然相对有限。同样，针对不同类别酶的底物和上下文特异性检测的多样性，限制了大规模测量和实验反馈所需的标准化。开发能够系统捕获这些代表性不足属性的实验平台，是扩展AI可解决设计空间的关键途径。
因此，AI驱动蛋白质设计的进展取决于计算建模和实验表征的相互整合。计算进展定义了假设和候选序列，而实验反馈则提供了校准、泛化和机制理解所需的定量数据。强调这种集成的设计-验证循环可能代表了该领域一个富有成效的方向，使模型能够扩展其设计能力。
虽然计算规模和模型复杂性的持续增加无疑将提高生成能力，但进展最终取决于实验反馈的分辨率和范围。未来的挑战不是将责任从模型开发者移交给实验人员，而是将两种视角统一到一个持续的、数据驱动的设计周期中。建立这种计算预测和实验验证之间的双重性，对于将当前AI驱动的蛋白质设计系统转变成为横跨分子生物学的通用、可解释和可部署的框架至关重要。
