《Journal of Archaeological Science》：Integration of age-at-death and novel peptide sex estimation reveals cattle culling practices at Yorkshire Iron Age shrine site
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本研究改进了质谱法用于牛牙 enamel的Amelogenin肽性别鉴定，提升准确性与效率。通过对英国肯平农场的40例牛牙样本分析，发现性别与aDNA结果一致，并与年龄分析结合揭示了屠宰模式符合常规管理，为高吞吐量方法在兽类研究中的应用提供了范例。
作者名单：Charllotte Blacka、Clare Rainsford、Ciarán G. O'Connor、Victoria E. Mullin、Daniel G. Bradley、Peter Halkon、Jackie Mosely、Kirsty Penkman、Jessica Hendy
所属机构：英国约克大学（University of York, York, UK）
摘要
在生物考古学领域，利用牙本质蛋白肽进行性别鉴定逐渐受到重视，新的研究致力于开发快速且成本低廉的方法，以实现对更多样本的性别鉴定。这些研究主要集中在人类遗骸上，而针对动物遗骸的牙本质蛋白肽分析相关研究非常少，同时也没有研究成功应用高通量技术对大量动物遗骸进行性别鉴定。本文对先前报道的TIMS-TOF（离子迁移率-飞行时间）质谱方法（Blacka等人，2025年）进行了改进，以提高其对牛遗骸性别的鉴定能力。该方法被用于分析从英国东约克郡Middleton-on-the-Wolds附近的Kipling House Farm发掘出的青铜时代晚期/铁器时代早期神龛/圣地中出土的40颗牛牙，从而揭示了该地区牛群的结构特征。快速牙本质蛋白肽分析结果与古DNA（aDNA）鉴定结果一致，但该方法扩展了数据集，使性别鉴定数量翻倍。结合死亡年龄估计，研究发现牛群在年龄结构上存在性别偏差，表明这些牛并非被特意挑选用于祭祀，而可能是正常淘汰过程中的牺牲品。这表明这类牛的屠宰行为反映了常规的畜群管理方式。因此，这项研究强调了高通量牙本质蛋白肽鉴定方法在深入理解动物考古学遗骸方面的价值。
引言
质谱技术（MS）在古代蛋白质分析（古蛋白质组学）中的应用是一个快速发展的研究领域，其研究范围涵盖饮食（Colonese等人，2017年；Maixner等人，2018年）、健康（Barbieri等人，2017年；Corthals等人，2012年）、分类学（Buckley等人，2009年；Cappellini等人，2019年；Welker等人，2019年）等多个方面。其中，通过分析牙釉质中的牙本质蛋白肽进行生物性别鉴定是一个特别快速发展的分支，目前主要集中在人类和人类祖先遗骸的研究上。针对动物遗骸的牙本质蛋白肽性别鉴定可为动物考古学和古生物学研究提供宝贵信息，有助于更深入地探讨畜牧实践和驯化过程（Berezina等人，2024年）。将这些性别鉴定结果与其他分析（如死亡年龄估计或稳定同位素分析）相结合，可以揭示数据中的性别相关特征，例如不同的畜牧方式或屠宰模式。不过，这种关联在很大程度上取决于遗骸的保存状况，因为性别鉴定基于骨盆结构，而死亡年龄信息则来自牙齿/下颌骨。由于动物考古学遗骸通常处于破碎状态，因此从不同骨骼元素中同时获取性别和死亡年龄信息较为复杂。牙本质蛋白肽鉴定方法能够绕过这些保存问题，因为它可以从同一骨骼元素（即带有牙齿的下颌骨）中提取性别、死亡年龄和饮食信息（Balasse，2002年；Balasse等人，2001年；Jones和Sadler，2012年），同时还能对那些无法通过形态学方法鉴定性别的未成熟个体进行性别鉴定。如果采用快速牙本质蛋白肽鉴定方法，还可以对大量样本（可能是某个遗址的所有个体）进行性别鉴定，从而获得群体层面的见解。
在许多真兽类哺乳动物中，牙本质蛋白基因位于性染色体上，分别编码X染色体相关异构体（AMELX）和Y染色体相关异构体（AMELY）（Lau等人，1989年；Nakahori等人，1991年）。通过提取并分析这些蛋白质在体内和体外降解过程中产生的肽（Robinson等人，1995年），可以鉴定许多哺乳动物遗骸的性别：仅存在AMELX表示雌性，同时存在AMELX和AMELY表示雄性（尽管存在因AMELY缺失、浓度低或降解导致的错误性别鉴定问题；Parker等人，2019年；Skov等人，2022年；?tamfelj，2021年；Ziganshin等人，2020年）。虽然理论上这种方法可以应用于多种哺乳动物，但目前大部分研究仍集中在人类祖先遗骸上，针对非人类物种的牙本质蛋白肽性别鉴定研究相对较少（Blacka等人，2025年；Bray等人，2025年；Buckley等人，2024年；Cappellini等人，2019年；Kotli等人，2025年）。
近期有研究将牙本质蛋白肽分析应用于牛的性别鉴定（Blacka等人，2025年；Buckley等人，2024年；Kotli等人，2024年），但牛牙中牙本质蛋白肽的离子峰强度和肽计数较低（Blacka等人，2025年；Buckley等人，2024年），这表明需要改进动物考古学遗骸的肽性别鉴定方法。本研究采用了改进后的Evosep-timsTOF质谱技术（Blacka等人，2025年），通过调整蚀刻酸的浓度和离子迁移参数来优化该方法。利用该方法，成功鉴定了来自英国东约克郡青铜时代晚期/铁器时代早期神龛/圣地遗址的40颗牛牙的性别。其中一半的性别鉴定结果通过古DNA分析得到验证，36个性别鉴定结果与死亡年龄估计结果相匹配，从而揭示了可能的屠宰模式。
样本信息
共从遗址中回收了41个编号的牛头骨，以及另外3对编号的下颌骨，总计至少44个个体牛头骨。此外，还在栅栏沟内发现了大量无法明确归属于特定头骨的颅骨和下颌骨碎片。在编号的头骨中，有36个保留了下颌骨，对其进行了死亡年龄估计；另有37个头骨保留了上颌或下颌牙齿。
肽性别鉴定
从LC-MS/MS数据中提取了肽离子强度总和及独特的牙本质蛋白肽计数（详见表S.2）。具有较高独特牙本质蛋白肽计数的样本也表现出更高的肽离子峰强度（图2）；如预期，AMELY肽的计数和信号强度较低，因为AMELY的表达水平低于AMELX（Salido等人，1992年）。
讨论
本研究将牙本质蛋白肽性别鉴定与死亡年龄信息相结合，揭示了牛屠宰过程中的性别选择性。尽管通过下颌骨的古DNA鉴定和牙齿萌出时间估计也能获得类似数据（McGrory等人，2012年），但蛋白质分析具有更广泛的应用范围和更低的成本，因此这种方法具有更大的潜力。
结论
本研究首次将群体范围内的快速肽性别鉴定和死亡年龄估计方法结合在一起，验证了这两种方法的可行性。Blacka等人（2025年）进一步改进了方法（调整蚀刻酸浓度和离子迁移参数），显著提高了牛牙本质蛋白数据的质量和可靠性，从而获得了可靠且可重复的性别鉴定结果。
资助信息
本项目属于“自然环境研究委员会（NERC）博士培训合作项目——适应环境变化挑战（ACCE）”[项目编号：NE/S00713X/1]的资助范围。古DNA分析由“欧洲研究委员会”在“欧盟地平线2020研究与创新计划”[项目编号：885729-AncestralWeave]下提供资助，同时得到了“Ireland Research Centre for Research Training in Genomics Data Science”[项目编号：18/CRT/6214]的支持。
作者贡献声明
Charllotte Blacka：负责数据分析、研究方法、可视化以及初稿撰写和审稿编辑。
Clare Rainsford：负责概念构思、数据分析、资源协调以及初稿撰写和审稿编辑。
Ciarán G. O'Connor：负责数据管理、数据分析、初稿撰写以及审稿编辑。
Victoria E. Mullin：负责数据管理、数据分析以及审稿编辑。
Daniel G. Bradley：负责审稿编辑。
利益冲突声明
作者声明不存在任何利益冲突。
致谢
作者感谢NERC ACCE DTP（项目编号：NE/S00713X/1）、欧洲研究委员会（项目编号：885729-AncestralWeave）和Ireland Research Centre（项目编号：18/CRT/6214）的资助；感谢James Lyall作为遗址发掘的联合负责人，以及David Orton教授在研究过程中的协助和对手稿的宝贵建议。约克质谱卓越中心的建立得益于Science City York的资本投资，以及Yorkshire Forward和Northern地区的资金支持。
