《Journal of Chromatography B》：Enhancing detection efficiency of RD-proteins in Mycobacterium tuberculosis culture filtrate by biomimetic affinity chromatography coupled with LC-MS/MS
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本研究通过六种生物模拟亲和色谱（BiAC）树脂分馏和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析结核分枝杆菌（MTB）培养滤液蛋白（MTB-CFPs），发现融合蛋白rEC与GmdA组合在结核诊断中表现优异，AUC达0.8030，显著区分患者与健康人，尤其适用于AFB阴性病例，为精准诊断提供新策略。
韩英晓|马松伟|马瑞|李静静|邱磊|马佳文|马燕燕|唐梦音|曹志娟|李子琪|张树林|马国荣
宁夏医科大学基础医学科学院，中国银川750004
摘要
结核分枝杆菌培养滤液蛋白（MTB-CFPs）对结核病的诊断和疫苗开发至关重要。为了探索其诊断潜力，将MTB在Sauton培养基中静态培养15天；收集MTB-CFPs，使用六种仿生亲和色谱（BiAC）树脂进行分离，并通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析。四种MTB特异性差异区域（RDs）和PstS1蛋白被重组表达和纯化，其血清学效果通过157例肺结核（pTB）患者和71例健康对照组（HCs）的血清进行ELISA评估。LC-MS/MS鉴定了622种MTB蛋白，其中307种蛋白的验证结果满足≥2个肽段且P值<0.05。BiAC分离显著增加了平均肽段数量（2.09倍）、肽段覆盖率（1.43倍）以及281个共有鉴定结果的指数修正蛋白质丰度指数（emPAI）（1.70倍）。接收者操作特征（ROC）分析显示，rEC（由RD1区域中的Rv3875和Rv3874基因通过15个核苷酸连接器融合表达的产物）是最优的诊断标志物，其曲线下面积（AUC=0.8030），pTB患者和HCs之间的IgG水平有显著差异（P<0.0001）。值得注意的是，rEC与GmdA（由位于RD11中的Rv1511基因编码）结合使用可提高敏感性，同时保持高特异性，特别是对于酸性-fast杆菌（AFB）阴性的pTB病例，显示出巨大的临床转化潜力。此外，延长培养时间促进了MTB的自溶和细胞质蛋白释放，为结核病发病机制和生物标志物的发现提供了宝贵的见解。这种结合了BiAC分离、蛋白质组学和血清学验证的综合方法提高了结核病诊断的准确性。
引言
结核病（TB）是由结核分枝杆菌（MTB）复合体引起的空气传播感染，给全球健康带来了沉重负担[1]。据估计，2024年全球有1070万新病例和123万死亡病例[1]。结核分枝杆菌培养滤液蛋白（MTB-CFPs）是最早与宿主免疫系统相互作用的蛋白质簇之一，它们调节宿主免疫、介导细胞损伤并促进MTB在细胞内的存活，因此对结核病的发病机制至关重要[2]。它们作为诊断标志物、疫苗成分和治疗靶点的有效性已经得到证实[3]、[4]、[5]，基于LC-MS/MS的研究也记录了这些应用[6]、[7]、[8]。
差异区域（RDs）是通过结核分枝杆菌复合体（MTBC）菌株的基因组比较鉴定出的MTB特异性基因片段[17]、[18]。MTB含有16个RDs，编码129个开放阅读框（ORFs），而卡介苗（BCG）菌株中缺乏部分RD基因[17]。鉴于其高特异性，RD编码的蛋白质是结核病精确诊断和新疫苗开发的关键靶点[19]。血清学检测有助于诊断细菌学阴性的肺结核和肺外结核，弥补了传统细菌学方法的局限性[20]、[21]。它通过IgG抗体滴度评估疾病活动性和治疗反应，非常适合资源有限环境下的高风险人群筛查。然而，这种方法在HIV感染者中假阴性率较高，这一限制可以通过多抗原联合检测得到缓解[20]、[21]、[22]。RDs与血清学检测（使用RD编码的蛋白质作为特异性抗原）的结合提高了血清学检测的准确性，从而强烈支持结核病的精确诊断[20]。
结核分枝杆菌是一种生长缓慢的病原体，世代时间为18-20小时[23]。MTB-CFP的蛋白质组谱与微生物表型、培养基成分和培养参数密切相关[23]、[24]。我们之前的研究通过对培养24天的MTB-CFPs进行系统蛋白质组学分析，鉴定出多种热休克蛋白和核糖体蛋白[8]，表明在细菌增殖过程中存在细胞质蛋白释放，可能是通过细胞裂解实现的。为了阐明MTB-CFPs在不同培养阶段的动态变化，本研究使用一致的方法分析了培养15天的MTB-CFPs蛋白质组，重点关注蛋白质组成变化、RDs基因编码的蛋白质对患者血清抗体的敏感性和特异性，以及它们作为结核病鉴别诊断生物标志物的潜力。总体而言，受控的MTB-CFPs蛋白质组学分析为优化结核病诊断、推进疫苗开发和研究结核分枝杆菌发病机制提供了关键数据。
试剂用于BiAC树脂的合成和评估
Sepharose-6FF购自武汉汇妍生物技术有限公司。2-氨基苯唑、氰化物、N-辛基胺、2,6-二氨基荧光醌、环氧氯丙烷、4-(2-氨基乙基)苯磺酰胺、氯化钠、己胺、丙酮、无水碳酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、硫代硫酸钠和二甲基亚砜（DMSO）均为分析级（AR）试剂，购自上海阿拉丁生化公司
使用多配体BiAC树脂分离MTB-CFPs
为了提高MTB-CFPs的检测覆盖率，使用了六种具有不同分子结构的BiAC树脂（A6–6、A17–18、A21–53、A56–51、A8–54和A115–94）以降低分析物的复杂性（图1A）。这些BiAC树脂包含三类小分子配体：5种线性化合物（编号6、8、21、56、94）、2种杂环胺化合物（编号17、18）和4种芳香族化合物（编号51、53、54、115）。
这六种BiAC树脂将MTB-CFPs分离成七个重叠的部分
结论
BiAC分离通过降低样本复杂性显著提高了MTB-CFPs的蛋白质组覆盖度，增加了肽段数量、肽段覆盖率和emPAI值。LC-MS/MS分析鉴定了622种MTB蛋白，其中细胞质蛋白占主导地位——这一发现表明它们的细胞外存在可能是由细菌自溶介导的。在测试的重组蛋白中，rEC表现出最佳的pTB诊断效果（AUC=0.8030）
CRediT作者贡献声明
韩英晓：撰写——初稿，正式分析，数据管理。马松伟：验证，软件处理，实验研究。马瑞：撰写——初稿，资金获取。李静静：实验研究，数据管理。邱磊：实验研究，数据管理。马佳文：验证，数据管理。马燕燕：正式分析，数据管理。唐梦音：正式分析，数据管理。曹志娟：正式分析，数据管理。李子琪：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，数据管理
未引用的参考文献
[9], [10], [11], [12], [14], [16]
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号82460026、82160027）、宁夏回族自治区自然科学基金（编号2025AAC030686、2025AAC030710）、国家重点研发计划（项目编号2023YFE0199200）以及宁夏回族自治区教育部门项目（编号NGY2024137）的支持
