《Journal of Inorganic Biochemistry》：Towards a dual copper(II) and iron(III) transmetalation strategy for an anticancer application with the deferasirox chelator
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铜铁双金属靶向策略通过转金属化干扰癌细胞金属稳态，临床铁螯合剂deferasirox（Def）与Ti(Def)?复合物在细胞内形成高活性Cu(II)和Fe(III) Def配合物，诱导氧化应激和凋亡。选择性靶向血清铜载体减少毒性。摘要：
Aixa M. Orta Rivera | Andrea N. Maser-Figueroa | Sergio A. Loza-Rosas | Israel Rodríguez | Luis A. Landrau Correa | Selene L. Schiavone-Chamorro | Angel L. Vázquez-Maldonado | Frances N. Serrano Martínez | Adriana I. Vargas Figueroa | Marta Jaskubasek | Alanis Zayas-Ortiz | Adriana P. Méndez-Fernández | Andrei V. Astashkin | Gilles Gasser | Lauren Fernández-Vega | Arthur D. Tinoco
波多黎各大学化学系，Río Piedras校区，Río Piedras，PR 0025-2537，美国
摘要
铜和铁是具有氧化还原活性的必需金属，癌细胞为了维持增殖、存活和转移，对这些金属的需求远高于正常细胞。它们之间复杂的生物学相互作用代表了一种普遍的代谢脆弱性，这种脆弱性可以被用于治疗。在本研究中，我们探讨了使用去铁胺（Def）及其钛(IV)复合物Ti(Def)?作为双重金属靶向策略的可能性，通过细胞内金属置换来破坏铜（Cu）和铁（Fe）的稳态。溶液物种分析和金属竞争研究表明，去铁胺对铜(II)的亲和力异常强，超出了基于HSAB理论的预测。紫外-可见光谱（UV-Vis）、电子顺磁共振（EPR）和质谱分析表明，在低微摩尔浓度下，铜(II)去铁胺物种主要以平面四方结构存在；而在较高浓度下则会发生盐依赖性的二聚化，这一现象得到了[X射线衍射] [Cu(Def)(py)]?复合物的支持。基于细胞的研究表明，去铁胺对铜(II)的结合可能有助于Ti(Def)?的细胞毒性作用。在A549肺癌细胞中，与不稳定的铜(II)的金属置换与先前报道的与铁(III)的金属置换相辅相成，生成了具有氧化还原活性的铜(II)去铁胺物种（Ec = 0.0398 V）和铁(III)去铁胺物种。在还原性的细胞内环境中，这些复合物可以发生还原性解离，增加细胞内的铜(I)和铁(II)水平，从而可能扰乱金属稳态。Ti(Def)?本身具有氧化还原惰性，因此铜和铁的去铁胺中间体被认为是活性氧（包括超氧化物）的主要来源，导致氧化应激和细胞凋亡。与血清中的铜载体蛋白发生的微量金属置换进一步证明了这种方法的细胞内选择性。综上所述，这些发现为利用铜和铁的金属置换驱动的氧化还原失调作为抗癌策略奠定了基础。
引言
铜（Cu）和铁（Fe）是人体多种生物过程中密切相关的两种必需金属。它们都具有氧化还原活性，可以参与彼此的氧化和还原反应。例如，多铜铁氧化酶（MCFs）如铜蓝蛋白、赫菲斯汀（hephaestin）和zyklopen在将Fe2+转化为Fe3+的过程中起着关键作用，从而通过铁转运蛋白ferroportin 1促进铁从细胞中释放，并实现铁在体内的分布。MCFs的缺乏会导致铁稳态的丧失，进而因铁的积累及其相关的氧化损伤而产生毒性。最近的研究发现，使用铜螯合剂cuprizone可以触发铁从细胞铁储存蛋白铁蛋白中的释放，并诱导铁死亡（ferroptosis），这是一种由铁介导的脂质过氧化增强的程序性细胞死亡。对铜和铁水平的严格调控对细胞存活至关重要。
正如它们对正常细胞的发育和复制至关重要一样，铜和铁在癌细胞的生长中也起着关键作用。癌细胞对这些金属的需求高于健康细胞，因此其细胞内含量也更高。尽管这两种金属都不被认为具有致癌性，但它们直接促进了癌细胞的快速增殖和转移。例如，快速的细胞增殖源于细胞内铜水平的升高，这加速了丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的激活；同时，铁依赖性的核糖核苷酸还原酶（RNR）的过表达促进了DNA的合成和修复，进而增加了DNA的复制。转移过程则得益于铜诱导的血管生成（angiogenesis）和上皮-间充质转化（EMT），以及铜通过与MEMO蛋白的相互作用来调节癌细胞的迁移。铜还促进了含铁基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases）的过表达，这些酶会降解细胞外基质，从而促进癌细胞的侵袭，进一步体现了铜和铁在癌症进展中的相互作用。
多个研究小组利用生理相关形式的铜和铁的配位化学特性，设计基于螯合的抗癌药物。在血清中，铜以Cu(I)和Cu(II)的形式存在（例如与铜蓝蛋白和血清白蛋白结合），而铁则以Fe(III)的形式与转铁蛋白结合。在细胞内，铜和铁的进出受到严格调控（铁的唯一输出蛋白ferroportin仅存在于特定细胞中），它们既以静态的蛋白质结合形式存在，也以动态的、不稳定的金属池形式存在（后者与低分子量配体弱结合）。由于细胞内的还原环境，Cu(I)和Cu(II)形式占主导地位。然而，它们的氧化形式Cu(II)和Fe(III)也对动态金属池有重要影响。最近的证据表明，癌细胞中的铜(II)水平升高。这些金属离子的细胞外和细胞内螯合剂（其中一些原本是为其他治疗目的设计的）被研究用于探索它们降低这些金属离子在细胞内的生物利用度和/或改变其行为的潜力。细胞外的Fe(III)和Cu(I)/Cu(II)螯合剂可以阻止这些金属被癌细胞吸收。有趣的是，Cu(I)/Cu(II)螯合剂使某些细胞系对顺铂（cisplatin）治疗更加敏感，这是因为高亲和力的Cu(I)转运蛋白Ctr1增加了细胞对顺铂的摄取。这种顺铂摄取的增加是由于细胞内Cu(I)水平的降低，从而驱动了Ctr1的表达增加。细胞内的Fe(II)/Fe(III)和Cu(I)/(II)螯合剂通过改变金属的功能来抑制铜诱导的血管生成和铁依赖性酶，导致细胞毒性效应，如铁死亡。
鉴于当前药物开发聚焦于基于靶点的发现，一种具有广泛作用的抗癌策略是同时针对癌细胞内的铜和铁。本研究展示了使用去铁胺（Def）这种螯合剂进行金属置换的可行性。去铁胺作为一种口服铁螯合剂，用于治疗铁过载疾病，其铜(II)结合能力出人意料地强。单核平面四方结构的Cu(Def)(pyridine)复合物表现出比单独使用去铁胺更强的细胞毒性。在此研究中，我们扩展了之前关于去铁胺的钛(IV)复合物Ti(Def)2的抗癌能力的研究，该复合物通过与不稳定的铁(III)的金属置换来增强Ti(IV)和去铁胺的细胞毒性协同作用，可能通过双重抑制RNR酶来实现这一效果。我们阐明了与不稳定的铜(II)的金属置换对Ti(Def)2细胞毒性的贡献。溶液物种分析和金属竞争研究揭示了去铁胺对铜(II)的亲和力远强于HSAB理论的预测。通过揭示细胞死亡机制的细节（这些机制可归因于铜和铁与去铁胺在Ti(Def)2金属置换后的相互作用及其相关的氧化还原活性），本研究建立了一个可微调的螯合剂模板，以优化对这两种金属的靶向效果。
材料
所有水溶液均使用高压灭菌（121°C和18 PSI）的高纯度纳米纯水（电阻率为18.2 MΩ·cm，使用PureLab Ultra Analytic水纯化系统）制备。所用试剂包括乙腈（ACN）、α-氰基-4-羟基肉桂酸、人铜蓝蛋白、二甲基甲酰胺（DMF）、N,N-二甲基-p-苯二胺、Erasstin、乙酸乙酯、Ferrostatin-1、氯化铁（FeCl3）、柠檬酸铁（Fe(C6H5O7）、硫酸铁（Fe2(SO4)3）、HEPES、己烷、N-乙酰半胱氨酸（NAC）和钛钾。
铜(II)在与钛(IV)和铁(III)的金属置换实验中表现出比预期更强的亲和力
根据硬软酸碱（Hard Soft Acid Base）理论，去铁胺对铜(II)的亲和力应该低于对硬路易斯酸钛(IV)和铁(III)的亲和力。先前的水溶液物种分析支持这一预期。在pH 7.4条件下，铜(II)会形成单核去铁胺物种Cu(Def)1?（log K = 18.8），其中去铁胺作为三齿配体，而水可能作为单齿配体来满足平面四方结构的形成。
结论
本研究通过紫外-可见光谱（UV-Vis）、电子顺磁共振（EPR）和MALDI TOF质谱（MALDI TOF MS）证实，在生理相关的水溶液条件下，去铁胺对铜(II)的亲和力远强于预期。这种亲和力似乎超过了HSAB理论所预测的钛(IV)和铁(III)的亲和力，这可能是由于铜(II)与其他两种金属离子的配位方式不同所致。这种配位方式的精确性质需要进一步的表征和计算分析。
CRediT作者贡献声明
Aixa M. Orta Rivera： 负责撰写、审稿与编辑、原始稿件的撰写、方法学设计、实验研究、数据分析、概念化。
Andrea N. Maser-Figueroa： 负责撰写、审稿与编辑、原始稿件的撰写、方法学设计、实验研究、数据分析、概念化。
Sergio A. Loza-Rosas： 负责撰写、审稿与编辑、原始稿件的撰写、方法学设计、实验研究、数据分析、概念化。
Israel Rodríguez： 负责方法学设计。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
我们感谢马萨诸塞大学阿默斯特分校的Rachid Skouta和Yuanchang Liu在铁死亡（ferroptosis）方面的贡献，以及波多黎各大学Río Piedras分校的Edwin O. Ortiz-Quiles和Carlos Cabrera在循环伏安法（cyclic voltammetry）方面的帮助。同时，我们也感谢Materials Characterization Center, Inc.提供的ESI-MS数据收集服务（特别是Mildred Rivera-Isaac的帮助）。X射线数据收集使用了NSF MRI项目（编号CHE-1626103）提供的仪器。
