《Neoplasia》：Characterizing the impact of MLL fusion variants and fusion partners on leukemia plasticity using a human CRISPR-engineered MLL-rearranged leukemia model
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为解析不同MLL融合伴侣及断裂点对MLL重排白血病发生发展的影响，研究团队利用CRISPR/Cas9技术在人类CD34+细胞中构建了包含MLL::AF4与MLL::AF9融合、且断裂点分别位于内含子9和11的白血病模型。研究发现，所有MLLr细胞均表现出增殖与干性增强，并具有独特的基因表达谱；其中MLL(intron 9)::AF9细胞在体内外展现出强大的致白血病能力和谱系可塑性。该模型为深入剖析MLL融合变异的机制及开发靶向疗法奠定了基础。
在儿童，尤其是婴儿急性白血病中，有一类特别的亚型预后极差，它们共同的特征是一个名为MLL（又称KMT2A）的基因发生了“重排”——也就是染色体断裂后，MLL基因的一部分“错误地”与另一个基因连接在了一起，形成一个新的融合基因。这种MLL重排白血病（MLLr）对标准化疗反应不佳，临床结局令人担忧。在众多的融合伙伴中，AF4（AFF1）和AF9（MLLT3）最为常见。不仅如此，MLL基因本身的断裂位置（例如主要发生在内含子9或内含子11）也可能影响疾病的特征和患者的预后。然而，不同的融合伙伴和断裂点究竟如何具体影响白血病的发生、发展以及细胞特性，长期以来缺乏能在同一遗传背景下进行直接比较的理想研究模型。
为了回答这些问题，来自苏黎世大学医院的研究团队在《Neoplasia》上发表了一项研究。他们巧妙地利用基因编辑“剪刀”CRISPR/Cas9技术，以来自同一供体的人类脐带血CD34+造血干/祖细胞为“画布”，精准地“绘制”出了四种不同的MLL重排白血病模型：分别是MLL内含子9与AF9融合、MLL内含子9与AF4融合、MLL内含子11与AF9融合、以及MLL内含子11与AF4融合。这样一来，他们就能在排除了供体个体差异的干扰下，直接比较“融合伙伴是谁”（AF4 vs AF9）和“断裂点在哪里”（内含子9 vs 内含子11）这两个因素各自对白血病细胞的影响。
关键技术方法
本研究主要运用了以下关键技术：1) 使用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在人类脐带血来源的CD34+细胞中诱导产生特定的MLL::AF4或MLL::AF9染色体易位。2) 利用数字液滴PCR(ddPCR)、荧光原位杂交(FISH)和核型分析对工程化细胞进行基因和染色体水平验证。3) 通过流式细胞术分析细胞表面免疫表型。4) 采用MACE-seq和RNA-seq进行转录组测序与生物信息学分析（如基因集变异分析GSVA）。5) 通过集落形成单位(CFU)实验评估细胞自我更新能力。6) 将工程化细胞移植到NOD scid gamma(NSG)免疫缺陷小鼠中进行异种移植实验，以评估其体内致白血病能力。
研究结果
诱导MLL重排导致MLLr细胞增殖优势并最终占据主导
研究人员成功利用CRISPR/Cas9在CD34+细胞中诱导了预期的MLL易位。基因组PCR、测序、FISH和核型分析均证实了t(4;11)或t(9;11)易位的成功产生。与仅转染Cas9的对照组野生型细胞相比，所有类型的MLLr细胞都表现出持续的增殖优势，在培养40至70天后，几乎形成了100%的MLLr细胞纯培养物。
CRISPR/Cas9生成的MLLr细胞呈现高原始细胞计数和未成熟标记，反映分化阻滞
通过细胞涂片染色分析，所有MLLr细胞都比对照组细胞表现出更不成熟的形态，具有更高比例的原始粒细胞。流式细胞术分析显示，所有MLLr细胞均表现出髓系免疫表型（CD19阴性，CD33高表达），并显著上调了与急性髓系白血病相关的标志物如CD32、CD9和CD123，同时下调了分化标志物CD14。MLL::AF9细胞的早期 progenitor 标志物CD117表达显著升高。
转录组测序分析表明，所有MLLr细胞中MLL相关信号通路活性均上调。比较不同断裂点（内含子9 vs 内含子11）时，仅发现12-18个基因表达存在显著差异。然而，比较不同融合伴侣（MLL::AF4 vs MLL::AF9）时，则发现了59-65个差异表达基因，表明融合伴侣对转录组的影响更为显著。这些差异基因中包含许多在白血病发生、干性维持中起关键作用的基因。
MLLr细胞对阿糖胞苷治疗敏感
所有MLLr细胞在阿糖胞苷处理后均呈现剂量依赖性的存活率下降。其中，MLL(9)::AF9细胞的半数抑制浓度最高，表明其对阿糖胞苷的敏感性相对较低。
经过长期体外培养后，仅MLL(9)::AF9细胞能在NSG小鼠中成功植活
集落形成实验显示，断裂点位于内含子9的MLLr细胞比断裂点位于内含子11的细胞具有更强的自我更新能力，这与它们更高的HOXA9基因表达水平相一致。当将长期体外培养后的MLLr细胞移植到NSG小鼠体内时，只有MLL(9)::AF9细胞能够在骨髓中成功植活并形成白血病浸润。
为了探究为何只有MLL(9)::AF9能成功植活，研究人员进一步分析了转录组数据。他们发现，与MLL(9)::AF4细胞相比，MLL(9)::AF9细胞中高表达CD163和MRC1等基因，这些基因是肿瘤支持性M2样巨噬细胞的标志物。流式细胞术确实在MLL(9)::AF9体外培养物中检测到了一群CD11b+CD163+CD206+的M2样巨噬细胞。此外，与植活和肿瘤生长相关的CD52分子在MLL(9)::AF9细胞表面表达也更高。
MLL(9)::AF9细胞在94天髓系体外培养后，在NSG小鼠体内仍保留谱系转换潜能
研究人员进一步分析了在体内植活的MLL(9)::AF9细胞。有趣的是，来自供体1的细胞在体内发生了从髓系到B淋巴系的谱系转换，表现为CD19表达上调，而髓系标志物CD15、CD33表达下调。而来自供体2的细胞在体内则保持了髓系表型。RNA-seq分析证实，供体1的体内细胞高表达淋巴系相关基因和转录因子。
深入分析发现，即使在移植前，供体1的体外培养细胞已经建立了一个以IKZF3和PAX5为中心的、更倾向于淋巴系的转录因子网络，这或许解释了为何其在体内环境中更容易转向B细胞命运。对同一供体不同移植小鼠的分析甚至显示，这些小鼠代表了B细胞分化不同阶段的状态，从未完全定型的多能状态到完全定型的B细胞状态。
在体内，MLL(9)::AF9细胞在不依赖KRAS突变的情况下激活了KRAS信号
对体内外细胞转录组的比较发现，在体内环境中，MLL(9)::AF9融合基因本身的表达水平普遍较低，且MLL驱动的信号通路活性下降。然而，多个KRAS相关的信号通路却在体内细胞中被激活，下游效应分子FOS和JUN的表达上调。基因组测序并未在KRAS基因的常见突变热点区检测到突变，这表明体内KRAS通路的激活可能源于微环境刺激或上游调控改变，而非遗传突变。
研究结论与意义
这项研究成功建立了一个在同一供体背景下、可同时比较不同MLL融合伴侣和断裂点影响的新型人源化CRISPR/Cas9 MLL重排白血病模型。研究得出以下主要结论：首先，MLL重排赋予细胞增殖优势和未成熟表型，其转录组特征同时受到融合伴侣和断裂点位置的影响，且融合伴侣的影响更大。其次，断裂点位于内含子9的细胞（尤其是MLL(9)::AF9）表现出更强的自我更新能力和体内致白血病潜能，这可能与其更高的HOXA9表达、以及细胞群体中存在的肿瘤支持性M2样巨噬细胞和CD52高表达有关。第三，MLL(9)::AF9细胞即使经过长期髓系条件培养，在体内仍保留显著的谱系可塑性，能够从髓系转换为B淋巴系，且这种可塑性存在供体间异质性，模拟了临床患者的差异。第四，在体内微环境下，白血病细胞的致癌信号通路会发生重编程，MLL融合基因本身的表达下调，而KRAS等替代信号通路被激活，这可能为白血病细胞提供了新的生存优势。
该研究的核心意义在于提供了一个强大而灵活的研究平台。这个平台首次允许在遗传背景相同的条件下，直接剖析MLL融合变异中“谁”（融合伴侣）和“在哪”（断裂点）这两个关键变量的独立与联合效应。它不仅能用于在体外深入探索MLLr白血病的发病机制，识别新的潜在治疗靶点，更能通过体内异种移植模型，在更接近生理的环境中研究白血病细胞的进化、可塑性与微环境互动。这为未来开发针对不同MLL融合亚型的精准靶向治疗策略奠定了坚实的模型基础，有望推动对这类难治性白血病治疗手段的革新。
