基于上转换纳米粒子的光激活CRISPR/Cas13d系统用于深部组织RNA靶向与骨坏死治疗

《Nature Communications》：Photoactivatable CRISPR/Cas13d via upconversion nanoparticles for deep tissue RNA engineering and orthopedic therapy

RNA疗法的时空控制是临床转化的一大挑战。为解决此难题，研究者们聚焦“光激活CRISPR/Cas13d (paCas13d)”系统主题，成功将可穿透组织的近红外光转化为蓝光，实现了在深层骨组织中精确控制RNA靶向。在类固醇相关性骨坏死小鼠模型中，此干预有效敲低TET3，破坏TET3-5hmC-PTEN轴，防止了骨组织恶化。该研究为需局部RNA调控疾病的治疗提供了一种非侵入性、可编程的新平台，意义重大。

　　

在精准医疗时代，如何像用遥控器指挥机器人那样，在身体深处对特定RNA分子进行“指哪打哪”的精确操作，是RNA疗法迈向临床的一大“痛点”。传统的基因编辑或RNA干预技术常常是“全局撒网”，容易产生全身性的副作用，而许多疾病，特别是骨科疾病，其病变部位深藏于骨骼内部，常规手段难以触及。想象一下，如果能用一束无害的光穿透皮肤和肌肉，像“神枪手”一样精准地消灭病灶处的致病RNA，那该有多酷？这正是研究者们梦寐以求的目标——实现对RNA疗法的时空控制（spatiotemporal control）。然而，现有的光遗传学工具多依赖穿透力弱的蓝光，难以抵达深层组织。于是，一项融合了前沿基因编辑技术、光学控制和纳米材料的新研究应运而生，旨在攻克这一难题。相关成果发表于《自然-通讯》（Nature Communications）上。

为开展这项研究，作者们主要运用了以下几项关键技术：首先，基于结构导向的蛋白质工程，对RfxCas13d蛋白进行拆分，并利用CRY2^PHR/CIBN光遗传学二聚化系统构建了光激活的CRISPR/Cas13d (paCas13d)系统。其次，合成了聚乙烯亚胺(PEI)功能化的上转换纳米粒子(UCNPs-PEI)，它同时作为基因载体和光子换能器，将可穿透组织的近红外光(NIR)转化为激活系统所需的蓝光。最后，在小鼠的类固醇相关性骨坏死(SAON)模型中，通过近红外光照射，在体评估了该系统对靶RNA的敲低效果及其治疗作用。

结果部分：

结构引导的paCas13d系统设计

研究人员通过对RfxCas13d蛋白结构进行分析，找到了合适的拆分位点，将其分割成两个片段。这两个片段分别与光敏蛋白CRY2^PHR和CIBN融合。在黑暗条件下，两个片段分离，Cas13d无活性；在蓝光照射下，CRY2^PHR与CIBN迅速二聚化，将两个Cas13d片段拉近并恢复其切割RNA的活性，从而实现了对Cas13d功能的“光控开关”。

UCNPs-PEI作为多功能递送和换能平台

为解决蓝光组织穿透力差的问题，研究团队开发了UCNPs-PEI纳米颗粒。这些纳米颗粒表面修饰的PEI有助于结合并压缩带负电的paCas13d质粒DNA，实现高效递送。更重要的是，UCNPs具有上转换发光特性，能够吸收穿透力强的近红外光，并将其转换为局部的蓝光发射，从而在深层组织中“远程”激活paCas13d系统。

体外和离体模型中的光控RNA敲低

研究证实，在细胞培养和骨组织离体培养模型中，经UCNPs-PEI递送paCas13d并施以近红外光照射，能够有效且特异性地敲低报告基因（如EGFP）和内源性靶基因（如TET3）的mRNA水平，且该效应严格受光照控制，显示出良好的时空特异性。

在体深部骨组织中的精确RNA靶向

在小鼠胫骨内注射UCNPs-PEI@paCas13d复合物后，通过体表近红外光照射，成功在小鼠的骨组织中实现了对靶基因mRNA的时空特异性敲低。实验证明，该系统的激活范围严格局限于光照区域，且对周围组织无影响，验证了其在复杂活体环境中进行精准干预的能力。

在类固醇相关性骨坏死模型中的治疗应用

研究人员将系统应用于SAON小鼠模型。他们设计靶向TET3（TET甲基胞嘧啶双加氧酶3）的paCas13d。糖皮质激素诱导的骨坏死与TET3表达上调及相关信号通路密切相关。近红外光激活的paCas13d有效敲低了骨细胞中的TET3 mRNA。机制上，TET3催化产生5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，进而调控PTEN等基因的表达，形成驱动骨细胞凋亡的“TET3-5hmC-PTEN轴”。干预该轴后，显著抑制了骨细胞凋亡。

骨坏死模型的治疗成效

治疗组小鼠的骨微结构得到显著保护，表现为骨小梁结构完整、骨体积分数增加、骨密度改善。骨转换标志物分析显示，骨吸收受到抑制，骨形成相对增强，整体骨代谢向有利方向转变。重要的是，该局部治疗并未影响糖皮质激素的全身性抗炎疗效，实现了治疗与副作用的“时空分离”。

研究结论与讨论，该研究成功开发了一种非侵入性、可时空编程的深部组织RNA靶向平台。其核心创新在于将可编程的CRISPR/Cas13d系统、光遗传学开关与深部组织光转换纳米材料三者巧妙结合，解决了RNA疗法在临床转化中面临的精准递送与可控激活两大关键挑战。在SAON模型中的应用，不仅验证了平台的可行性，更揭示了一条由TET3-5hmC-PTEN轴介导的糖皮质激素诱导骨坏死的新机制，并为干预该机制提供了特异性工具。该平台的设计理念具有普适性，通过替换CRISPR/Cas13d的向导RNA(gRNA)，理论上可以对任何RNA靶点进行光控操作，为多种需要局部RNA调控的疾病（如肿瘤、纤维化疾病、局部炎症等）的治疗提供了全新的技术思路和潜在方案，是合成生物学、纳米医学与再生医学交叉融合的典范。