《Animal Cells and Systems》：Influences of pupal presence and worker number on the survival and development of pharaoh ant (Monomorium pharaonis) brood under laboratory conditions
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为优化实验室条件下蚂蚁基因功能研究中的人工蚁群构建，提升蚁卵孵化与幼体存活率，本研究探讨了法老蚁（Monomorium pharaonis）亚蚁群中蛹的补充和工蚁数量对蚁卵存活与发育的影响。研究发现，补充蛹和保持足够的工蚁数量能显著提高蚁卵存活率、加速幼虫发育。这为建立高效的蚂蚁功能遗传学研究基础，区分基因编辑试剂毒性与饲养环境因素提供了关键条件。
在真社会性昆虫的世界里，蚁群是一个精密运转的超有机体。蚁卵、幼虫和蛹等幼体（brood）极度依赖成年工蚁的照料，包括喂养、清洁和保护。这种社会性抚育是蚁群得以繁衍壮大的基石。然而，在实验室环境下，当研究人员需要建立小型的人工蚁群来进行功能遗传学研究（例如利用CRISPR-Cas9进行基因编辑）时，如何维持这些脆弱幼体的高存活率，成了一个棘手的问题。将经过显微注射等处理的胚胎放回庞大的原种蚁群几乎无法追踪，而小型人工蚁群的饲养条件又往往难以把控。蚁卵的低存活率，究竟是由于基因操作本身的影响，还是饲养环境不佳所致？这常常难以区分，阻碍了相关研究的进展。
因此，建立一个标准化的、高效的实验室蚁群饲养方案，明确维持幼体存活与正常发育所需的最小社会组成，成为了一个亟待解决的关键问题。法老蚁作为一种具有多后制、巢友识别度低、易于在实验室形成高密度群体等特性的入侵性蚂蚁，是功能遗传学研究的理想模型。本研究旨在探究在实验室维持的法老蚁亚蚁群中，社会组成——特别是蛹的存在和工蚁的数量——如何影响完整蚁卵的存活与发育。
本研究采用了实验室控制条件下的亚蚁群建立与观察方法。研究使用的法老蚁原种蚁群来自韩国首尔的采集个体。实验在标准培养皿中进行，通过精确控制温度、光照和湿度，并定期提供食物。关键的技术方法包括：1) 构建不同社会组成的实验蚁群，系统性地设置“有无蛹补充”和“不同工蚁数量（5、10、20、40只）”的组别，每组设置9个重复以控制变异；2) 引入统一数量的新鲜蚁卵（10枚）作为目标观察对象；3) 周期性（每5天）补充蛹（3个）以维持稳定的群体结构，并调整工蚁数量以保持初始水平；4) 定期（每5天）监测并记录由引入蚁卵发育而来的幼体的存活数量及其发育阶段（胚胎、幼虫、预蛹、蛹、成虫）；5) 利用卡普兰-迈耶（Kaplan-Meier）生存分析、曼-惠特尼U检验（Mann-Whitney U test）和克鲁斯卡尔-沃利斯检验（Kruskal-Wallis test）等统计方法，分析不同处理组在幼体存活率、成功羽化为成虫的数量以及各发育阶段持续时间上的差异。
Pupal supplementation enhances brood survival
研究人员首先测试了蛹的存在对幼体存活的影响。实验设置包含20只工蚁和10枚蚁卵的蚁群，一组补充3个蛹，另一组不补充。结果表明，补充蛹显著提高了幼体的整体存活率，并且从这些蚁卵中成功羽化出的成虫数量也显著更多。这强有力地证明，在亚蚁群中补充蛹能极大地促进幼体的存活。
Pupal supplementation accelerates brood development
进一步的发育分析显示，蛹的补充不仅提高存活率，还加速了发育过程。在有蛹补充的蚁群中，幼体从幼虫到预蛹、再到蛹、最后到成虫的阶段转换，至少比无蛹组提前了5天。具体来说，幼虫期的平均持续时间在有蛹条件下显著缩短，而蛹期的持续时间在两组间没有差异。这说明蛹的补充主要影响并加速了幼虫阶段的发育。此外，研究还观察到，仅在补充了蛹的蚁群中，有部分幼体发育成了有性生殖个体（雌蚁或雄蚁），其幼虫期比工蚁型个体更长。
Worker number influences brood survival
接下来，研究探讨了工蚁数量的影响。在均补充3个蛹的条件下，设置了5、10、20、40只工蚁的不同组别。生存分析显示，不同工蚁数量组的幼体存活率存在显著差异。其中，拥有20只工蚁的蚁群，其幼体存活率显著高于5只和10只工蚁的蚁群。虽然各组成虫成功羽化数量的组间差异未达到统计显著性，但将数据汇总后进行两两比较发现，20只工蚁组的成功率显著高于5只和10只组。这表明，足够的工蚁数量对幼体存活至关重要。
Worker number modulates brood developmental speed
工蚁数量同样影响了发育速度。在工蚁数量较少的组（如5只工蚁）中，幼体（无论是发育为工蚁还是有性生殖个体）的发育阶段转换出现延迟。具体而言，对于发育为工蚁的个体，5只工蚁组的幼虫期显著长于40只工蚁组。发育为有性生殖的个体也表现出类似趋势，其幼虫期普遍长于同组别的工蚁型个体。然而，各组的蛹期没有显著差异。这说明，工蚁数量主要影响幼虫期的发育速度，与蛹补充的效应模式一致。
本研究的结论和讨论部分深刻阐释了社会组成对实验室饲养法老蚁幼体的关键作用。研究发现，特定的社会因素组合——即补充蛹并维持20只左右的工蚁群体——为实验研究创造了一个高效的饲养环境，能显著提升蚁卵存活率和成虫羽化成功率。这凸显了社会互动在实验室饲养体系中的重要性。
关于蛹在幼体发育中的作用，其显著的促进效应可能源于蛹与工蚁、幼虫之间的社会互动。近期研究指出，蚂蚁蛹的蜕皮液含有促进幼虫生长和存活的营养有机物。在本实验中，蛹的存在很可能通过工蚁为发育中的幼虫提供了额外的营养来源（即社会性体液），从而缩短了发育时间并降低了死亡率。这揭示了蚁群内可能存在跨发育阶段的复杂营养网络。
关于可行的蚁群规模、人口统计学与工蚁数量，研究证实了工蚁介导的抚育对幼体生长的核心影响。拥有足够数量的工蚁对于高效的分工、从而加速幼体发育至关重要。20只工蚁的蚁群表现最佳，可能代表了本实验条件下的一个有利规模。补充3个蛹的比例（相对于20只工蚁）符合法老蚁蚁群中标准的品级比例。这表明，维持接近自然蚁群的人口统计学平衡（品级比例）对人工蚁群的功能至关重要。有趣的是，将工蚁数量增至40只并未带来进一步的改善，这意味着蚁群内部的人口统计学平衡可能比单纯增加工蚁数量更为关键。法老蚁作为一种通过分巢（budding）建立新蚁群的物种，其生态特性可能使其对人工蚁群中的人口统计学失衡特别敏感。
研究还观察到一个有趣现象：在实验室饲养系统中产生有性生殖个体。无蛹补充的蚁群中没有产生有性生殖个体，而在有蛹且工蚁数量较多的条件下，则有更多有性生殖个体出现。在法老蚁中，有生殖力蚁后的存在会通过后信息素抑制新有性生殖个体的产生。本实验未引入蚁后，这可能为有性生殖个体的发育创造了条件，但其成功成熟很可能需要适宜的饲养环境。蚁群人口统计学的稳定（通过补充蛹和增加工蚁数量）可能增强了社会互动的效能，进而改善了幼体的营养状况，促进了有性生殖的产生。这一发现对于在遗传研究中建立稳定的遗传品系具有价值。
最后，本研究对未来基因组编辑研究具有重要意义。尽管实验使用的是完整、未经注射的蚁卵，但其发现对基因组编辑研究影响深远。以往蚂蚁的CRISPR-Cas9研究中，低孵化率和羽化率常被归因于注射创伤。而本研究数据表明，不理想的社会环境也可能是导致幼体死亡的一个重要因素。通过应用本文确定的最佳饲养条件，研究人员可以最大限度地减少由环境压力引起的背景死亡率，从而确保在未来实验中观察到的致死效应能更准确地归因于基因编辑过程本身，而非恶劣的饲养条件。因此，这项研究为改善蚂蚁分子遗传学研究的效率和可重复性提供了一个实用的先决步骤和基础框架。
