《BioTechniques》：RP-HPLC-based purification of long single-stranded DNA for CRISPR knock-in applications
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背景 长链单链DNA (long single-stranded DNA, ssDNA; >200核苷酸) 在DNA纳米技术、精准医疗以及作为CRISPR-Cas9敲入供体模板方面具有重要价值，但现有的制备方法步骤繁琐、产量低或难以规模化。方法 研究人员
背景 长链单链DNA (long single-stranded DNA, ssDNA; >200核苷酸) 在DNA纳米技术、精准医疗以及作为CRISPR-Cas9敲入供体模板方面具有重要价值，但现有的制备方法步骤繁琐、产量低或难以规模化。方法 研究人员开发了一种结合酶切消化与高温反相高效液相色谱(reversed-phase high-performance liquid chromatography, RP-HPLC)的工作流程，用于纯化千碱基长度的ssDNA。该方法在分析级和半制备级规模上进行了评估。结果 该方法能够清晰分离1.5至4.5 kb的线性和环状ssDNA，并可在不同规模间进行扩展。一个1.5 kb的ssDNA供体在原代人CD8+T细胞的T细胞受体α恒定区(T-cell receptor alpha constant, TRAC)位点支持了高效的CRISPR敲入，且未对细胞活力和扩增产生不利影响。结论 该RP-HPLC工作流程为生成长链ssDNA提供了一种可规模化、可重复的方法，适用于基因组工程应用。
研究背景、问题与目的
长链单链DNA(ssDNA, >200 nt)是DNA纳米技术和CRISPR-Cas9介导基因敲入(Knock-in)实验的重要工具，因其相对于双链DNA(dsDNA)供体能降低由cGAS–STING通路介导的细胞免疫反应激活风险，从而在多种细胞系统中展现出优势。然而，传统制备长链ssDNA的方法，如λ-外切酶消化、生物素-链霉亲和素下拉法、非对称PCR或变性凝胶电泳等，普遍存在步骤繁琐、产量低(通常仅数微克至数十微克)、纯度难以保证或难以规模化放大等问题，这已成为制约其在临床转化、精准肿瘤学等领域大剂量应用的关键瓶颈。为了满足基因组编辑应用（例如，单次电转数以百万计的原代T细胞通常需要5–20 μg ssDNA供体）对高质量、高纯度、可规模化长链ssDNA供体的需求，研究人员探索并建立了一种基于高温反相高效液相色谱(RP-HPLC)的新型纯化策略，以期提供一种可重复、高通量的制备方案。本项研究发表于《BioTechniques》期刊。
关键技术与方法概览
研究人员采用了酶切与色谱联用的工作流程。首先，通过限制性内切酶Nt.BbvCI在特定位点切割质粒DNA，使其松弛化。随后，将消化产物在80°C高温下，通过使用DNAPac? RP色谱柱的反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分离，利用三乙胺醋酸酯(TEAA)和乙腈的梯度洗脱，成功分离出不同长度和拓扑结构的ssDNA组分。目标ssDNA组分经过超滤离心管进行缓冲液置换以去除有机溶剂。该方法在分析型(2.1 × 50 mm)和半制备型(10 × 150 mm)色谱柱上均得到验证。最终，将纯化后的1.5 kb ssDNA供体与原代人CD8+T细胞（来自三名独立的健康供体，由BioIVT提供）一同电转，用于评估其在T细胞受体α恒定区(TRAC)位点的CRISPR敲入效率。
研究结果
3.1. 阴离子交换高效液相色谱(AEX-HPLC)质控确认质粒完全松弛
研究人员利用AEX-HPLC监测了质粒经BbvCI消化后的拓扑结构变化。消化前的质粒呈现单一的尖锐超螺旋峰。消化后，该超螺旋峰消失，代之以一个洗脱时间略有提前的开环质粒峰。这证实了质粒被完全松弛，避免了任何未被消化的dsDNA污染进入后续的RP-HPLC步骤。
3.2. RP-HPLC分离与验证长链ssDNA异构体
在80°C运行条件下，DNAPac? RP色谱柱能将松弛的质粒清晰地分离为三种ssDNA成分。色谱图显示了三个可重复的UV吸收峰，分别对应于1.5 kb的线性ssDNA（GFP插入片段）、3.0 kb的线性ssDNA（残余骨架链）和4.5 kb的环状ssDNA（互补骨架链）。目标1.5 kb ssDNA与3.0 kb ssDNA实现了基线分离，有利于获得高纯度的同源定向修复模板(HDRT)。对收集的组分进行变性碱性琼脂糖凝胶电泳分析，证实了各峰的组分归属，目标峰呈现为单一预期大小的条带，未见明显的dsDNA污染，验证了RP-HPLC方法制备长链ssDNA的高纯度。该方法的总体回收率约为67%，其中目标1.5 kb链的回收率约为22%。
3.3. RP?HPLC纯化的ssDNA具有良好的耐受性并能实现剂量响应性CRISPR敲入
研究人员在电穿孔条件下，将RP-HPLC纯化的1.5 kb GFP编码ssDNA HDRT与靶向TRAC位点的Cas9核糖核蛋白(RNP)复合物共同递送到原代人CD8+T细胞中。细胞活力和扩增监测数据显示，在3 μg或4 μg每1×106细胞的不同ssDNA剂量下，细胞活力和扩增与仅电穿孔对照(EP control)相比均无显著差异，表明纯化后的ssDNA供体在常规电穿孔剂量下未表现出明显的细胞毒性。在敲入效率方面，流式细胞术分析显示，GFP阳性细胞的比例随ssDNA供体剂量的增加而上升。单因素重复测量方差分析(ANOVA)表明，ssDNA剂量对敲入效率有显著影响。这一结果表明，RP-HPLC纯化的长链ssDNA HDRT能够支持原代T细胞中高效且可剂量调控的基因编辑。
讨论与结论总结
研究人员在讨论中对比了多种色谱纯化策略，指出DNAPac? RP色谱柱是唯一能成功分离ssDNA组分并适用于规模放大的工具。该工作流程的建立解决了规模化生产高纯度长链ssDNA的技术瓶颈。研究结论如下：RP-HPLC可清晰地分离和规模化制备来自酶切质粒的长链ssDNA，所得产物纯度高，能够支持原代T细胞中的高效敲入，且不产生可检测的毒性。该方法为基因组编辑及相关应用提供了可重复、可规模化的解决方案。
