大肠杆菌中葡萄糖与甘油共利用实现NMN的高效生产：一种缓解生长-产物矛盾的新策略

《Microorganisms》：High-Level Production of NMN in Escherichia coli Through Co-Utilization of Glucose and Glycerol Jiajia Gan, Xiuzhen Chen, Yongzhi He, Yanfeng Zhang, Jin Zhong and Zhiyang Dong

本研究针对NMN微生物发酵生产中细胞生长与产物合成之间的“权衡”问题，提出并验证了一种葡萄糖与甘油共利用的代谢工程策略。通过敲除糖酵解关键基因（pgi, pykA/pykF）并引入反馈抑制不敏感型甘油激酶（glpK*），成功引导葡萄糖优先流向NMN合成，同时利用甘油支持细胞生长，最终在2 L发酵罐中实现了32.92 g/L的NMN产量。该策略显著提升了碳转化效率，为NMN的工业化规模生产提供了有效方案。

　　

随着全球人口老龄化趋势加剧，寻找能够延缓衰老、维持健康状态的物质成为科学界和产业界关注的焦点。烟酰胺单核苷酸（Nicotinamide mononucleotide, NMN），作为关键辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）的直接前体，因其在提升细胞内NAD⁺水平、改善衰老相关代谢紊乱方面的潜力，已成为抗衰老营养品和功能性食品添加剂领域的新星。然而，传统的NMN化学合成法存在反应条件苛刻、环境污染大等问题，而体外酶催化法又受限于酶的成本与稳定性。因此，利用微生物细胞工厂进行高效、可持续的发酵生产，成为更具前景的产业化路径。

在利用大肠杆菌等微生物生产NMN的研究中，一个核心的瓶颈问题浮出水面：细胞生长与产物合成之间存在固有的“权衡”关系。NMN的生物合成主要依赖于补救途径，其关键前体物质5′-磷酸核糖-1-焦磷酸（phosphoribosyl pyrophosphate, PRPP）来源于磷酸戊糖（pentose phosphate, PP）途径。而葡萄糖作为主要碳源，其代谢流在糖酵解（Embden–Meyerhof–Parnas, EMP pathway）和PP途径之间存在竞争。若想增加流向PP途径的碳流以合成更多PRPP，通常需要削弱糖酵解，但这又会严重损害细胞的生长和能量代谢，反而限制了最终产物的积累。如何打破这一僵局，实现生长与生产的“双赢”，是推动NMN高效生产的关键。

近期发表在《Microorganisms》上的一项研究，为我们提供了一个巧妙的解决方案。该研究团队独辟蹊径，提出并实践了一种“碳源分工”策略：让葡萄糖“专心”生产NMN，而让另一种碳源“负责”支持细胞生长。他们选择了廉价易得的生物柴油副产物——甘油，作为这个“后勤部长”。通过精妙的代谢工程改造，研究人员构建了一株能够高效共利用葡萄糖和甘油的大肠杆菌工程菌，成功在2 L发酵罐中实现了32.92 g/L的NMN高产，为解决微生物发酵法生产NMN及其他PP途径衍生化学品的“生长-产物矛盾”提供了新思路。

本研究主要采用了以下关键技术方法：首先，运用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对出发菌株NMN008进行基因敲除与替换。其次，通过摇瓶水平的全细胞催化实验，系统评估了不同基因改造及碳源条件对菌株生长、底物消耗和NMN产量的影响。最后，在2 L生物反应器中进行了高细胞密度分批补料发酵，以验证工程菌的工业化生产潜力。

3.1. 通过削弱糖酵解的葡萄糖消耗来增强NMN生物合成

为了验证削弱糖酵解能否将更多碳流导向PP途径，研究人员在NMN008菌株中依次敲除了糖酵解关键基因pgi（编码磷酸葡萄糖异构酶）、pykA和pykF（编码丙酮酸激酶），得到菌株GN01。实验结果表明，这一改造确实有效。在摇瓶全细胞催化中，GN01菌株以更少的葡萄糖消耗（5.17 g/L）生产了更多的NMN（4.05 g/L），其葡萄糖转化效率显著高于原始菌株NMN008（消耗11.87 g/L葡萄糖，生产3.25 g/L NMN）。这证实了削弱糖酵解可以促进碳流重新分配，有利于PRPP的生成和NMN的合成。然而，糖酵解途径的破坏带来了严重的副作用：GN01菌株的生长受到了极大抑制，其生物量（OD₆₀₀= 3.31）相较于原始菌株（OD₆₀₀= 8.6）下降了61.51%。这种生长缺陷是高密度发酵和工业化应用的主要障碍。

3.2. 通过葡萄糖和甘油的共利用增强NMN生物合成

为了解决GN01菌株的生长缺陷，研究团队引入了“碳源共利用”策略。他们希望甘油能作为支持细胞生长的次级碳源，而葡萄糖则专用于NMN合成。为了增强菌株在葡萄糖存在时对甘油的利用能力，研究人员将野生型甘油激酶基因glpK替换为一个反馈抑制不敏感型突变体glpK* (GlpK^G913A)，构建了菌株GN02。实验证明，这一改造非常成功。在以甘油为唯一碳源时，GN02菌株的生长和甘油消耗量均显著优于GN01。在葡萄糖和甘油混合碳源条件下，GN02同样表现出更优的生长性能。更重要的是，在混合碳源（葡萄糖:甘油=1:1）条件下进行全细胞催化时，GN02菌株的NMN产量达到8.30 g/L，显著高于以葡萄糖为唯一碳源时的产量（6.94 g/L），也高于未引入glpK的GN01菌株在混合碳源下的产量（6.08 g/L）。这些数据表明，引入glpK促进了葡萄糖和甘油的共利用，有效缓解了因削弱糖酵解导致的生长抑制，并协同提高了NMN的生物合成能力。

3.3. 通过高细胞密度发酵生产NMN

为了评估GN02菌株的工业化生产潜力，研究团队在2 L生物反应器中进行了分批补料发酵。他们采用葡萄糖和甘油混合碳源（1:1）持续流加，并连续供应底物NAM。经过72小时发酵，最终菌株GN02的NMN产量达到了32.92 g/L，对葡萄糖的得率为0.80 g/g，总碳转化效率为0.39 g/g。在整个发酵过程中，菌体生物量保持稳定，溶解氧（dissolved oxygen, DO）曲线也相对平稳。与此前仅使用葡萄糖的出发菌株NMN008相比（产量26.07 g/L，且在生产期细胞密度下降、DO急剧上升），GN02菌株在产量上提升了26.28%，碳转化效率提升了34.48%，并且细胞生理状态更加稳定。这证明葡萄糖-甘油共利用策略有效增强了细胞的呼吸活性和生长稳定性，从而保障了NMN的高效合成。

4. 结论

本研究成功证明，通过葡萄糖与甘油共利用的代谢工程策略，可以有效缓解NMN生物合成中细胞生长与产物积累之间的固有矛盾。其核心在于对中心碳代谢流进行重新编程：通过敲除糖酵解关键基因（pgi, pykA/pykF），迫使葡萄糖更多地进入PP途径用于生成PRPP和合成NMN；同时，通过引入反馈抑制不敏感型甘油激酶（glpK*），强化甘油代谢通路，使其在葡萄糖存在下也能被高效利用，从而为细胞生长和能量代谢提供支持。这种“碳源分工”模式，使得葡萄糖和甘油各司其职，最终实现了在不牺牲细胞生长的前提下，大幅度提高NMN产量和碳转化效率的目标。

该研究的成功不仅为NMN的工业化规模生产提供了一条高效、可持续且经济可行的新路径，其揭示的代谢工程策略——即利用混合碳源协调解决生长与生产的权衡问题——具有更广泛的启示意义。该策略可被推广应用于其他依赖于PP途径前体（如PRPP）的生物合成过程，为通过微生物细胞工厂生产核苷、维生素、辅酶及相关药物前体等高价值化学品提供了宝贵的思路范式和有力的技术支撑。尽管本研究取得了显著成效，但其中涉及的碳通量重新分布的具体代谢机制尚未完全阐明，未来的研究可通过整合代谢组学和¹³C代谢通量分析进行深入探索，从而为NMN生物合成效率的迭代优化提供定量指导。