一种用于临床样本中利什曼原虫检测及其种水平鉴定的整合分子方法

《Microbiology Spectrum》：An integrated molecular approach for the detection and species-level identification of Leishmania spp. in clinical samples

　　

摘要 利什曼病是由受感染的白蛉传播的寄生虫病，流行于98个以上的国家。准确的诊断工具对于预防和控制至关重要，特别是在非流行区。研究人员提出了一种标准化的分子工作流程，该流程结合了两种基于聚合酶链反应（PCR）的策略：通过扩增保守的利什曼原虫动基体DNA（kDNA）微环进行敏感检测，以及通过对一段1116个碱基对（bp）的热休克蛋白（hsp）70基因片段进行测序来进行虫种鉴定。优化后的kDNA-PCR检测达到了如下检测限：对婴儿利什曼原虫（Leishmania (Leishmania) infantum）为0.05个寄生虫/毫升，对巴西利什曼原虫（Leishmania (Viannia) braziliensis）为0.5个寄生虫/毫升，这两种是阿根廷最常见的虫种。该方法还能够与恰加斯病和地方性真菌病进行鉴别诊断。对来自83名患者的150份临床样本的评估显示，与显微镜检查相比，其灵敏度为69.7%，特异性为68%，性能有所改善。8例kDNA-PCR“假阳性”病例通过hsp70测序被确认为真实感染。共鉴定出四个虫种：巴西利什曼原虫、圭亚那利什曼原虫（Leishmania (Viannia) guyanensis）、巴拿马利什曼原虫（Leishmania (Viannia) panamensis）和墨西哥利什曼原虫（Leishmania (Leishmania) mexicana）。该工作流程为资源有限的流行地区提供了一种可靠的诊断和种水平鉴定工具。

研究背景、问题与研究动机

利什曼病是由动基体目、锥虫科的原生动物寄生虫引起的媒介传播寄生虫病，是全球范围内重大的健康问题，也是最主要的被忽视热带病之一，全球每年报告新发病例在70万至100万之间。其临床表现多样，包括皮肤型、黏膜皮肤型和内脏型。在阿根廷，美洲皮肤利什曼病是美国皮肤黏膜利什曼病（ATL）的临床表现，已成为日益严峻的公共卫生挑战。利什曼原虫种类繁多（如巴西利什曼原虫、婴儿利什曼原虫等），且不同虫种导致的疾病病理、治疗反应和预后均有差异，因此准确的种水平鉴定对于指导治疗和流行病学监测至关重要。

然而，当前诊断方法存在显著局限性。直接显微镜检查作为常规参考方法，存在操作者依赖性、敏感性和特异性不理想等问题，难以检测低寄生虫载量。虽然以高拷贝数的动基体DNA（kDNA）为靶标的PCR检测具有高灵敏度，但通常只能鉴定到属或亚属水平。而用于种水平鉴定的分子标记物（如hsp70基因）虽然可靠，但其灵敏度不足以作为初步诊断工具。此外，在流行区，利什曼病与恰加斯病、地方性真菌病等临床表现相似的疾病存在鉴别诊断的挑战。因此，亟需开发一种集高灵敏度检测与准确种水平鉴定于一体的标准化、实用的分子诊断工作流程。本研究正是为了应对这一需求而开展的，旨在评估一种结合kDNA-PCR检测与hsp70测序分型的整合分子方法，以提升诊断准确性，并为资源有限的流行地区提供有效工具。

研究目的与意义

本研究旨在评估一种用于利什曼原虫检测和种水平鉴定的标准化分子诊断工作流程。其核心假设是，将靶向kDNA的诊断性PCR与基于hsp70的分子分型相结合，能构成一种更灵敏、更特异的寄生虫检测和虫种鉴定方法。该研究不仅提出了一种用于寄生虫分子检测的PCR方案，还强调了确定感染虫种在治疗决策中的重要性。研究成果发表在《Microbiology Spectrum》期刊上，对改善患者管理、支持流行病学监测和加强区域利什曼病防控能力具有重要意义。

关键技术方法概述

研究人员开展了一项横断面描述性研究，样本来自2015年至2024年间在阿根廷布宜诺斯艾利斯大学医院就诊的、有利什曼病临床疑似表现的83名患者，共包括150份临床样本（如涂片、活检、拭子等）。研究采用的关键技术方法主要包括：1. 优化并标准化了针对利什曼原虫kDNA微环保守区域的PCR（kDNA-PCR）检测方案，包括重新设计引物、优化反应体系与循环条件，并在多重PCR中加入了人β-球蛋白基因作为内参。2. 系统评估了该kDNA-PCR的分析特异性（针对相关病原体如克氏锥虫、荚膜组织胞浆菌等）和分析灵敏度（检测限）。3. 使用优化的kDNA-PCR对临床样本进行检测，并以显微镜检查为参考方法，评估其诊断性能（灵敏度、特异性等）。4. 对所有kDNA-PCR阳性样本，进一步通过PCR扩增、测序及系统发育分析hsp70基因片段，以确定感染虫种及其种内变异。

研究结果

kDNA-PCR的标准化

研究人员优化了kDNA微环保守区域的扩增（kDNA-PCR）。通过重新设计引物以平衡Tm值，优化PCR反应混合物成分和循环条件，并整合了人β-球蛋白基因作为内部对照，成功建立了稳定的检测方法。优化过程使用了阿根廷相关利什曼原虫虫种的参考菌株DNA进行验证。

kDNA-PCR的特异性

kDNA-PCR对利什曼原虫属表现出高特异性，与克氏锥虫、荚膜组织胞浆菌、巴西副球孢子菌、念珠菌属、巴西孢子丝菌等临床和地理分布有重叠的病原体无交叉反应，实现了有效的鉴别诊断。来自未感染人血的DNA也未产生扩增产物。

kDNA-PCR的分析灵敏度

为确定检测限（LoD），使用人血DNA为基质制备了标准寄生虫曲线。结果显示，该kDNA-PCR对婴儿利什曼原虫的LoD为0.05个寄生虫/毫升，对巴西利什曼原虫为0.5个寄生虫/毫升，表明其能够检测低寄生虫载量的感染。

kDNA-PCR的诊断性能

对83名临床疑似患者的150份样本进行评估。以显微镜检查为参考标准，kDNA-PCR的整体灵敏度为69.70%，特异性为68.00%。研究指出，显微镜检查作为不完善的参考标准，其局限性（如操作者依赖性、低灵敏度）可能影响了kDNA-PCR性能的评估。有16名患者仅PCR阳性，10名患者仅显微镜检查阳性。在后续分析中，发现8例显微镜检查阴性但PCR阳性的样本（最初视为PCR假阳性）通过hsp70测序被确认为真实感染。诊断性能因临床类型和样本类型而异，例如，在黏膜皮肤利什曼病诊断中特异性较低，可能与病灶寄生虫载量低有关；活检和拭子样本显示出较高的特异性。

利什曼原虫虫种分型

对所有kDNA-PCR阳性样本进行hsp70基因序列分析以确定虫种。成功对来自26名确诊患者的35份样本进行了虫种鉴定。共鉴定出四种利什曼原虫：巴西利什曼原虫、圭亚那利什曼原虫、巴拿马利什曼原虫和墨西哥利什曼原虫，其中巴西利什曼原虫最为常见。系统发育分析将临床序列与全球参考菌株聚类，从而完成虫种归属。

此外，hsp70标记的分析还揭示了种内变异。例如，在巴西利什曼原虫中发现了多个单倍型，最常见的单倍型HP22与所有临床形式相关且地理分布广泛。在个别患者中，治疗后检测到了寄生虫单倍型的选择性变化，或在同一患者不同黏膜部位发现了不同的序列变异，提示可能存在治疗诱导的种群选择或宿主内寄生虫群体的异质性分布。单倍型网络分析进一步阐明了巴西利什曼原虫变异体之间的遗传关系。

讨论与结论总结

在讨论部分，研究人员强调了世界卫生组织路线图中准确诊断的重要性。他们指出，尽管基于PCR的方法表现出优越的分析性能，但缺乏经过验证的标准化方案限制了其广泛应用。本研究评估的kDNA-PCR方案在分析灵敏度、特异性以及对流行区相关病原体的鉴别诊断方面表现出色。其诊断性能评估受到显微镜检查作为不完善参考标准的限制，但PCR检测到的额外阳性病例（特别是通过hsp70测序确认的病例）很可能代表了被显微镜漏检的真实感染。

虫种鉴定是诊断过程中关键但常被忽视的一步，因为感染特征和治疗反应很大程度上受寄生虫虫种影响。本研究提出的诊断工作流程整合了高灵敏度的kDNA-PCR检测步骤和基于全球已验证的hsp70基因标记的虫种鉴定步骤，解决了当前诊断方法的局限。该工作流程成功识别了阿根廷临床样本中循环的多种利什曼原虫虫种，包括巴西利什曼原虫和第二次在国内检出的巴拿马利什曼原虫，突显了持续进行虫种水平监测的必要性。hsp70标记的分析还为研究种内变异和可能的治疗选择压力提供了见解。

最后，研究人员承认了本研究的局限性，包括单中心设计、回顾性性质以及缺乏外部验证。他们建议未来在更大多中心数据集中应用潜在类别模型可能更准确地估计分子检测的真实诊断性能。同时，将血清学检测整合到该工作流程中有望进一步提高诊断准确性。

研究结论：本研究评估的诊断工作流程为利什曼原虫的检测和鉴定提供了一个稳健而灵活的策略，解决了当前诊断方法的关键局限。结合使用kDNA-PCR进行灵敏检测和基于hsp70的测序进行虫种鉴定，构成了一个强大的临床决策和流行病学监测工具。该工作流程显著提高了灵敏度、特异性和种水平分辨率，代表了在实现更准确、标准化诊断方面迈出的重要一步。