《Computational Biology and Chemistry》：Filling in the blanks: In silico prediction of novel type III secreted effectors in the Pseudomonas syringae species complex
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预测III型分泌效应蛋白（T3SE）面临序列多样性高和工具假阳性多的问题。本研究开发整合Effectidor2、Bastion3等工具的生物信息学工作流程，通过多方法元分析和定制化EffRank评分，将57个P. syringae全基因组中283个候选T3SE筛选至15个高置信度预测，最终确认3个新T3SE（PsaNZ45_RS26420、ACOZ4J_RS28825、RRP28_RS13015）。分析显示核心基因组进化群（PG）1携带更保守且丰富的T3SE，而假阳性YenB样毒素多出现在群组2。
Iva Rosi? | Marina Soki? | Tamara Rankovi? | Olja Medi? | Tanja Beri? | Slavi?a Stankovi? | Marcus M. Dillon | Ivan Nikoli?
贝尔格莱德大学，物理研究所，塞尔维亚贝尔格莱德
摘要
由于细菌III型分泌效应因子（T3SEs）的序列多样性极高，且我们严重依赖先前注释基因的特征来进行预测，因此预测这些效应因子仍然具有挑战性。现有的T3SS效应因子预测工具会产生大量假阳性结果，这使得它们的可靠识别变得复杂。为了解决这一问题，我们开发了一种新的生物信息学工作流程和元分析方法，通过整合多种互补的方法（包括Effectidor2、Bastion3、EffectiveT3、精心整理的效应因子数据库、全对全BLAST比对、比较基因组学以及基于定位的特征）来提高对新T3SEs预测的信心。我们将这种方法应用于57个完整的P. syringae基因组，该物种的致病性与其III型分泌效应因子（T3SEs）的含量密切相关，从而将最初的283个候选T3SEs减少到15个高置信度预测。通过应用我们新定制的EffRank评分流程，有三个候选因子被确定为P. syringae菌株中的高置信度新型T3SEs：PsaNZ45_RS26420（P. syringae pv. actinidiae ICMP20586）、ACOZ4J_RS28825（P. syringae pv. actinidiae FX219）和RRP28_RS13015（P. syringae pv. actinidiae Yunnan2.4）。此外，我们的评分流程还成功检测并去除了那些在早期筛选步骤中仍被保留的高置信度候选因子中的可能假阳性T3SEs（如YenB类毒素），这突显了当前公开可用预测工具的挑战性和偏见。最后，我们还描述了每个菌株的最终T3SE库，这些库与基于核心基因组的系统发育聚类结果一致。正如预期的那样，PG1菌株拥有更大且更保守的T3SE库，并贡献了大多数有前景的新型T3SE候选因子，而可能的假阳性YenB类毒素则出现在PG2菌株中。
引言
Pseudomonas syringae是一个包含13个系统发育群、23个支系和超过60个致病型的多样化物种复合体（Parisi等人，2019年）。它包括来自水、土壤和大气的环境分离株，以及那些与植物生命周期密切相关的菌株，在植物中它们可以作为病原体或共生体（Xin等人，2018年）。同一P. syringae系统发育群内的菌株具有非常高的基因组相似性（98-99%的ANI），反映了强烈的进化一致性。然而，不同系统发育群之间的ANI值下降到94-95%，接近物种边界，这导致一些人认为这些系统发育群可能代表不同的物种（Dillon等人，2019a；Newberry等人，2019年）。
P. syringae菌株之所以能够与植物有效互动，部分原因在于它们能够在植物表面恶劣的条件下生存。然而，在这个初始的附生阶段之后，大多数致病性P. syringae菌株必须进入质外体，在那里它们会遇到一系列充满挑战的环境（Arnold和Preston，2019年；Thomas等人，2024年）。具体来说，质外体是一个营养有限且具有免疫反应的环境，细菌的毒力因子对于成功定植至关重要。在这个阶段，P. syringae利用多种毒力因子来绕过宿主防御并获取必需的资源。这些毒力因子包括抑制早期免疫反应途径的蛋白质、干扰植物激素信号传导以及破坏细胞壁的蛋白质，共同创造了一个更有利于感染的环境（Cowles等人，2025年）。特定P. syringae菌株的定植机制具有谱系特异性，因为不同系统发育群之间的毒力因子库可能存在显著差异。植物病原性P. syringae（主要来自PG1-6和PG10）的特点是产生诸如植毒素（coronatine、syringomycin、syringolin、phaseolotoxin）等毒力因子，以及有助于生物膜形成的胞外多糖，以及多种通常协同作用的T3SEs。相比之下，环境分离株（主要来自PG7-9和PG11-13）通常缺乏毒素，编码的T3SEs较少，仅引起植物的机会性疾病（Xin等人，2018年；Lv等人，2023年）。
P. syringae所利用的毒力因子大致可分为两类：非T3SE类和T3SE类。非T3SE类毒力因子包括那些参与运动性、生物膜形成、冰核活性以及通过多种分泌系统（T1SS、T2SS、T5SS、T6SS）分泌的胞外酶和植毒素的因子（Pontes等人，2020年）。另一方面，T3SE类毒力因子包括通过III型分泌系统（T3SS）分泌的T3SEs及其辅助因子，这种类似注射器的分泌装置可以将T3SEs传递到植物细胞的细胞质中（Jin等人，2023年）。对于大多数P. syringae菌株来说，T3SEs对植物致病性至关重要，尽管它们对毒力的相对贡献在不同系统发育群中有所不同（Dillon等人，2019a）。在植物有益的P. syringae菌株中也发现了T3SEs的同源物，这挑战了T3SEs仅限于致病性分离株的假设（Passera等人，2019年）。因此，识别新型T3SEs不仅有助于理解植物致病机制，还有助于发现可能增强有益相互作用的T3SEs。最终，新型T3SE的发现可以提供关于宿主适应性的见解，解释毒力变异，并可能指向新的生物控制策略。
T3SEs通过主动抑制模式触发免疫（PTI）和效应子触发免疫（ETI），通过靶向激酶、操纵磷酸化级联反应以及干扰外囊复合体中的囊泡运输来帮助病原体成功破坏宿主免疫，从而阻断免疫物质的分泌和自噬（Lindeberg等人，2019年；Wang等人，2019年；Wang等人，2019年）。为了通过T3SS分泌，大多数P. syringae T3SEs具有几个特征性的N端结构：一个富含丝氨酸的无结构分泌信号、位于3-4位置的疏水残基（异亮氨酸/亮氨酸/缬氨酸/脯氨酸），以及前12个氨基酸中缺乏酸性残基。这些特征在早期的T3SE预测中被广泛用作启发式方法（Chang等人，2005年；Moreno-Pérez等人，2020年）。最近的研究强调了其他特征的重要性，包括整个蛋白质序列中的氨基酸组成、调节T3SE表达的上游hrp-box启动子基序的存在，以及T3SEs的基因组背景，这些T3SEs通常聚集在致病性岛上。这些额外特征大大提高了P. syringae中T3SE的识别和区分准确性（Lovelace等人，2023年），使得不同的P. syringae T3SEs能够被赋予独特的Hop编号（Hrp依赖性外蛋白），这已经取代了传统上基于其无毒活性的Avr编号（Dillon等人，2019a；O’Malley等人，2021年）。目前P. syringae中已识别出70多个T3SE家族，还有几个新的家族尚未被发现（Nikoli?等人，2023年）。其中一些T3SE在许多菌株中是保守的，属于软核基因组（例如AvrE、HopM、HopAA），而其他一些则更具菌株特异性，通常位于可变区域，如可交换效应因子位点（EEL）（Rankovi?等人，2023年）。
尽管有这些方法上的进步，但在体外预测新型T3SEs仍然是一个主要挑战，因为需要捕捉所有真实的T3SEs同时避免包含过多的假阳性T3SEs。就捕捉所有真实T3SEs而言，T3SEs的高序列多样性意味着许多T3SEs缺乏用于训练现有机器学习工具的典型特征。另一方面，由于非T3SE基因与T3SEs具有相似的进化起源，因此很难避免误识别假阳性T3SEs。这个问题在嵌合T3SEs中尤为常见，这些T3SEs被认为是通过末端重组产生的，即一个真实T3SE的N端区域与一个非T3SE的C端区域结合（Stavrinides等人，2006年）。这些嵌合T3SEs在同一基因组中创建了T3SEs和非T3SEs之间的同源性轨迹，这使得区分它们极其困难。由于这些挑战，现有的T3SE识别工具存在相当大的不确定性，经常产生包含大量假阳性的候选T3SEs集合。我们建议统一现有工具并进行更仔细的过滤和优先排序，以帮助区分真正的新型T3SEs，通过将实验集中在更有可能代表真实T3SEs的高置信度预测集上来提高实验验证的效率。
本研究的目的是建立一个分为三个阶段的T3SE预测工作流程和元分析框架，并使用P. syringae作为模型生物来验证其性能（图1）。首先，我们利用Effectidor2（Wagner等人，2025年）在57个P. syringae基因组中生成了一个初步的新型T3SEs集合。其次，我们使用其他一系列程序和数据库对这一初步集合进行了精细化处理。最后，我们将所有这些程序的输出整合到一个T3SE评分流程中，该流程旨在为体外验证提供更好的候选者优先级，为每个假定的效应因子分配一个数值分数。作为研究的一部分，还开发了相应的代码。最终，我们建立了一个高置信度、可重复的体外 T3SE预测工作流程，其效果比任何现有的单独工具都更有效地指导T3SE的定向实验验证。
Effectidor2预测
第一阶段：初步T3SEs预测和分组
为了评估预测模型的性能，我们使用了Effectidor和T3SE参考文件中的AUPRC值来验证所有已知T3SEs的检测情况。此外，我们还检查了被赋予最高和最低AUPRC值的T3SEs，以确认它们是否包含在预测文件中。我们还注意到了那些AUPRC值低于Top 10组中最后一个潜在T3SE但高于0.4截止值的潜在T3SE的数量（超过这个阈值的蛋白质被认为是
讨论
计算生物学和效应子预测的最新发展越来越突显了依赖单一预测工具的局限性，特别是对于具有高序列多样性或非典型特征的蛋白质。几项最近的研究强调了需要采用综合的、多层次的方法，结合来自序列的特征、结构信息和基因组背景，以减少假阳性结果并提高检测准确性
资助
本工作得到了塞尔维亚共和国科学、技术发展和创新部[资助编号451-03-136/2025-03/200178, 451-03-137/2025-03/200178]和国际遗传工程与生物技术中心[资助编号CRP/SRB23-04_EC]的支持。作者还感谢塞尔维亚共和国科学、技术发展和创新部通过其资助提供的支持。
CRediT作者贡献声明
Marina Soki?：方法学、数据管理。
Iva Rosi?：撰写——初稿、可视化、方法学、数据管理。
Slavi?a Stankovi?：撰写——审阅与编辑、验证、资源管理。
Tanja Beri?：撰写——审阅与编辑、验证。
Olja Medi?：研究、数据管理。
Tamara Rankovi?：研究、数据管理。
Ivan Nikoli?：撰写——审阅与编辑、验证、监督、资源管理、概念化。
Marcus M. Dillon：撰写——审阅与编辑、验证
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
研究数据
补充表格：
包含EffectiveT3、Bastion3、LOCALIZER和全对全BLAST结果的Excel文件；Roary基因
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
