《Experimental Cell Research》：Arginase 2 regulates cholesterol biosynthesis in endothelial cells
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Arg2通过调控甲羟戊酸途径影响内皮胆固醇合成且独立于酶活性。研究采用CRISPR/Cas9敲除Arg2在HUVECs中，发现Arg2缺失显著下调胆固醇合成相关基因（HMGCS1、FDFT1等）及产物，而过表达 wild-type 或突变型Arg2（H160F）则上调这些基因。该机制揭示了Arg2在连接氨基酸与脂代谢中的新功能，为动脉粥样硬化等心血管疾病提供新靶点。
张一芳|余梦瑶|黄吉
湖南省心血管疾病研究所，湖南省动脉硬化重点实验室，中南大学衡阳医学院湖南省动脉硬化国际科技合作基地，湖南省衡阳市，421001，中国
摘要
背景
精氨酸酶2（Arg 2）是一种线粒体酶，可将L-精氨酸水解为L-鸟氨酸和尿素，从而影响内皮细胞中的一氧化氮（NO）的生物利用度和血管功能。尽管Arg 2在高胆固醇和氧化应激条件下与内皮功能障碍有关，但其在内皮胆固醇代谢中的潜在作用仍不清楚。
方法
使用CRISPR/Cas9技术在永生化的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中删除了Arg 2基因，随后进行了转录组分析。通过定量RT-PCR和免疫印迹验证了差异基因表达。通过重组慢病毒转导实现了野生型Arg 2和催化失活的Arg 2（H160F）突变体的过表达。通过比色法测量尿素生成量来量化精氨酸酶活性，利用LC–MS技术测定胆固醇中间产物。
结果
RNA测序显示，Arg 2的缺失显著下调了参与甲瓦龙酸和类固醇生物合成途径的基因，包括HMGCS1、FDFT1、FDPS、SQLE和DHCR7。这些转录变化伴随着关键胆固醇合成酶的蛋白质水平下降以及细胞内固醇（羊毛甾醇、去甲甾醇和胆固醇）浓度的降低。相反，野生型Arg 2或催化失活的Arg 2（H160F）突变体的过表达增强了这些酶的表达。
结论
这些发现揭示了Arg 2在促进内皮胆固醇合成方面的一个先前未被认识的作用。除了与内皮NO合成酶竞争L-精氨酸外，Arg 2可能通过调节甲瓦龙酸途径来调节血管稳态，这一作用与其酶活性无关。这种双重功能可能将内皮中的氨基酸代谢和脂质代谢联系起来，并暗示了Arg 2导致内皮功能障碍和动脉粥样硬化进展的新机制。
引言
内皮细胞（ECs）构成血管的内层，在维持血管稳态中起着关键作用，其胆固醇平衡对血管健康至关重要[1]。与肝细胞不同，内皮细胞的从头合成胆固醇的能力有限，因此主要依赖于胆固醇的摄取和转运机制[2]。虽然内皮细胞不是主要的胆固醇生成细胞，但胆固醇合成在维持内皮膜完整性、脂质筏组成、细胞内信号传导和正常血管功能方面仍具有重要的局部调节作用[[3],[4],[5],[6]]。然而，调控内皮细胞胆固醇合成的机制尚未完全明了。
精氨酸酶2（Arg 2）是一种线粒体酶，可催化L-精氨酸水解为L-鸟氨酸和尿素。由于L-精氨酸也是内皮一氧化氮合成酶（eNOS）的底物，而eNOS可产生一氧化氮（NO），因此Arg 2与eNOS竞争L-精氨酸[7]。在生理或受控应激条件下，精氨酸酶活性有助于内皮修复和重塑。精氨酸酶产生的L-鸟氨酸作为多胺（腐胺、亚精胺、精胺）的前体，促进细胞增殖和血管生成，并作为脯氨酸的前体支持胶原蛋白合成和组织修复[8,9]。然而，过高的精氨酸酶活性会减少用于NO合成的精氨酸量，从而导致NO生物利用度下降，最终引发内皮功能障碍，这是动脉粥样硬化、高血压和其他心血管疾病发展的关键早期事件[[10],[11],[12]]。
尽管许多研究表明Arg 2在高胆固醇或氧化脂质条件下与内皮功能障碍有关[[13],[14],[15],[16]]，但目前尚无证据表明Arg 2直接影响内皮细胞的胆固醇合成。因此，本研究旨在探讨Arg 2在内皮胆固醇合成中的作用。
材料
试剂从以下来源购买或获得：针对ACAT-2的兔抗体（Ab）（100027）来自Cayman；针对精氨酸酶2（#55003）和HMGCS1（#42201）的兔抗体来自Cell Signaling Technology；针对HMGCR（PA5-37367）和FDPS（PA5-28228）的兔抗体来自Invitrogen；针对FDFT1（13128-1-AP）、SQLE（12544-1-AP）、LSS（13715-1-AP）的兔抗体以及针对β-actin（66009-1-lg）的小鼠抗体来自Proteintech；HRP Goat Anti-Rabbit IgG（H + L）
在永生化HUVECs中删除精氨酸酶2
先前的研究表明，Arg 2参与多种动物疾病模型中的内皮功能障碍。然而，Arg 2在内皮细胞中的病理生理功能仍不完全清楚。 clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR-associated protein 9（Cas9）系统是一种广泛使用的基因编辑工具。在这里，我们使用该系统在永生化HUVECs（IM-HUVECs）中敲除了Arg 2基因
讨论
越来越多的证据表明，在多种病理生理情况下，内皮精氨酸酶的表达和/或活性升高，并在与衰老、糖尿病和动脉粥样硬化相关的内皮功能障碍中起关键作用[14,19,31,32]。在本研究中，我们发现了Arg 2在调节内皮胆固醇代谢方面的一个先前未被认识的作用。通过CRISPR/Cas9介导的基因删除和转录组分析，在永生化HUVECs中观察到...
资助
本研究得到了国家自然科学基金（82100789）和湖南省自然科学基金（2022JJ40378）的支持。
CRediT作者贡献声明
张一芳：研究、方法学、项目管理、撰写——审稿与编辑。余梦瑶：数据分析、方法学、撰写——审稿与编辑。黄吉：概念构思、数据分析、资金获取、项目管理、监督、初稿撰写、审稿与编辑。
利益冲突声明
所有作者声明与本文的发表没有利益冲突。
