《Frontiers in Microbiology》：An MKT1 domain protein is dispensable for erythrocytic stages of plasmodium falciparum
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为探索MKT1结构域蛋白在恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）有性及无性发育阶段中的作用，研究人员通过CRISPR-Cas9基因敲除、免疫荧光定位、生长与配子体发生实验等多重手段，系统评估了PfMKT1的功能。结果发现，PfMKT1在疟原虫红细胞期的无性增殖、配子体形成以及配子发生过程中均非必需，该研究为深入理解疟原虫生活周期调控机制提供了新的分子视角，并为抗疟药物靶点筛选提供了重要参考。
疟疾是全球最重要的传染病之一，其致病病原体恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）的生活史极为复杂，涉及人体内的无性繁殖与蚊体内的有性繁殖两个关键阶段。在人体红细胞内，疟原虫通过无性增殖迅速扩增，引发临床症状；而部分寄生虫会分化为配子体（gametocyte），这些有性形式被蚊媒摄取后，在蚊中肠内快速分化为雌雄配子（gamete），进而完成受精并启动后续传播周期。因此，阐明配子体形成与配子发生的分子调控机制，对于阻断疟疾传播具有重要意义。
在真核生物中，MKT1（Maintenance of K2 Killer Toxin）结构域蛋白是XPG/RAD2核酸酶家族成员，已知在转录后基因调控、细胞分化以及应激应答中发挥关键作用。该蛋白在酵母、植物、原生动物乃至人类中均保守存在，并在锥虫（Trypanosoma brucei）和新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）中被证实参与mRNA稳定性维持与有性发育。然而，在疟原虫中，MKT1同源蛋白（PfMKT1）是否在生活史尤其是性阶段发育中具有功能，此前尚未明确。由于前期转录组数据显示PfMKT1在成熟配子体（stage V）中表达最高，且其在性发育关键激酶Pfsrpk1敲除株中表达下调，研究人员推测PfMKT1可能参与疟原虫的性发育调控。为此，本研究通过系统功能实验，探索了PfMKT1在恶性疟原虫红细胞期（包括无性增殖与有性发育）中的作用。
该研究整体发表于《Frontiers in Microbiology》期刊。在方法学上，作者主要运用了以下几项关键技术：首先，通过生物信息学分析鉴定并注释了PfMKT1的蛋白结构域，并利用AlphaFold2进行三维结构预测；其次，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了PfMKT1敲除株（Pfmkt1ˉ），并通过PCR与RT-PCR验证了敲除效率；再者，采用间接免疫荧光（IFA）技术检测了PfMKT1在无性各期（环状体、滋养体、裂殖体）以及有性各期（II–V期配子体）中的定位；最后，通过体外培养与镜检，比较了野生型与敲除株在无性生长、配子体发生率以及配子形成能力方面的表型差异。所有实验均以恶性疟原虫NF54野生株为对照，并在需要时进行了统计学分析。
研究结果
PfMKT1在疟原虫无性与有性阶段的表达与定位
通过结构预测发现，PfMKT1包含典型的MKT1 N端和C端结构域，提示其可能参与转录后调控。系统发育分析显示，恶性疟原虫与疟原虫属其他物种的MKT1在序列上存在较高分歧，尤其是MKT1 N与C结构域。半定量RT-PCR结果显示，PfMKT1转录本在所有无性阶段（环状体、滋养体、裂殖体）以及成熟配子体（stage V）中均有表达，且在滋养体期表达最强。免疫荧光定位进一步证实，PfMKT1在无性各期及有性各期（II–V期配子体）中均有表达，并且定位于细胞质；同时，该蛋白在雄性配子体（α-Tubulin标记）和雌性配子体（Pfs25标记）中均被检测到。
PfMKT1敲除株的构建与表型分析
利用CRISPR-Cas9技术成功构建了PfMKT1完全敲除株（Pfmkt1ˉ），并通过多对基因型PCR与RT-PCR验证了敲除的彻底性。生长曲线实验显示，敲除株在无性增殖速率上与野生型无显著差异，表明PfMKT1对疟原虫红细胞内无性复制并非必需。
PfMKT1敲除对配子体发生与配子形成无显著影响
通过体外诱导配子体形成，发现Pfmkt1ˉ敲除株能够正常分化为成熟的V期配子体，其配子体发生率（gametocytemia）与野生型相当。免疫荧光染色进一步证实，敲除株的雄性配子体（α-Tubulin标记）和雌性配子体（Pfs25标记）形态发育正常。更重要的是，在体外激活条件下，敲除株的配子体能够正常进行配子发生（gametogenesis），形成具鞭毛的雄性配子（microgamete）和雌性配子（macrogamete），且与野生型相比无显著缺陷。
结论与讨论
本研究首次在恶性疟原虫中鉴定了MKT1结构域蛋白PfMKT1，并系统评价了其在红细胞期发育中的功能。尽管前期证据提示该蛋白可能参与性发育调控，但基因敲除实验表明，PfMKT1在恶性疟原虫的无性增殖、配子体发生以及配子形成过程中均非必需。这一结果与MKT1在锥虫和隐球菌中的关键作用形成鲜明对比，提示PfMKT1在疟原虫中的功能可能发生了分化，或者其功能在标准实验室条件下被冗余机制所补偿。
值得注意的是，PfMKT1在恶性疟原虫的配子体阶段表达量最高，且其转录本在Pfsrpk1敲除株中下调，说明该蛋白仍可能通过与其他RNA结合蛋白（如已报道的PfRNF1、PfMD3）形成复合物，在转录后调控中扮演角色。此外，磷酸化蛋白质组学数据显示PfMKT1在裂殖体和配子体阶段存在多个磷酸化位点，提示其可能被CDPK4、SRPK1等性阶段高表达的激酶所调控，进而影响其RNA结合活性。
综上所述，本研究明确了PfMKT1在恶性疟原虫红细胞期发育中的非必需性，为深入理解疟原虫生活史调控网络的复杂性提供了重要数据。未来研究可进一步探索PfMKT1在蚊期发育（如卵囊发育与孢子形成）中的作用，以及其在其他疟原虫物种（尤其是与人类感染相关的物种）中的功能演化，这或许能为发现疟原虫生命周期中的关键薄弱环节提供新线索。
