基于ATR-FTIR、LC-MS/MS和HPLC技术对Paris polyphylla var. yunnanensis的绿色茎和紫色茎在表型质量上的差异进行分析

《Journal of Chromatography A》：Analysis of phenotypic quality differences between green and purple stems of Paris. polyphylla var. yunnanensis based on ATR-FTIR, LC-MS/MS and HPLC

基于云南重楼地上部分的ATR-FTIR和LC-MS/MS分析，揭示了紫茎与绿茎表型差异的代谢特征，发现异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷为唯一特异性差异代谢物，并鉴定AMPK信号通路。结合HPLC定量九种皂苷，构建PLSR预测模型实现质量控制。

　　

马慧|朱新燕|王元中

中国云南省农业科学院药用植物研究所，昆明650200

摘要

Paris polyphylla var. yunnanensis是一种多年生草本植物，其药用部分为根茎。然而，目前关于其地上部分的研究仍然不足，尤其是能够直接反映药效作用的生物表型评估和质量评估尚不清楚，这限制了对其药用价值的深入探索。为此，本研究利用衰减全反射傅里叶变换红外（ATR-FTIR）光谱技术，分析了P. polyphylla var. yunnanensis两种表型不同部位的光谱差异，获得了与P. polyphylla var. yunnanensis化学成分相关的官能团信息。随后，通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术进一步研究了不同部位的总体化学特性。通过独特的代谢物分析，我们发现Isorhamnetin-3-O-neohesperidoside在PS（P. polyphylla var. yunnanensis的紫茎）组中显著上调，而该化合物是PS组和GS组中独有的差异代谢物。在KEGG分析中，AMPK信号通路在PS组和GS组中均得到富集。为了了解两种表型之间的质量差异，我们使用高效液相色谱（HPLC）测定了P. polyphylla var. yunnanensis不同部位中的九种皂苷含量。结果表明，总皂苷含量最高的组为GL（P. polyphylla var. yunnanensis的绿叶）组和PL（P. polyphylla var. yunnanensis的紫叶）组，这两部分均属于地上部分。同时，Polyphyllin I在PR（P. polyphylla var. yunnanensis的紫根茎）组和GR（P. polyphylla var. yunnanensis的绿根茎）组中的含量较高。最后，我们结合ATR-FTIR和HPLC技术构建了PLSR定量预测模型，实现了对三个质量控制指标的快速评估。

引言

Paris polyphylla var. yunnanensis是云南“十大云药”之一，是80多种中药专利药的关键原料，包括云南白药和公序宁。它来源于百合科（Liliaceae A.L. Jussieu）Paris L.的干燥根茎。根茎可用于治疗昆虫叮咬、疼痛、肿胀和咽喉痛[1]。在Paris L.属植物中，P. polyphylla var. yunnanensis因其卓越的药用价值和显著的生物活性而成为使用最广泛、市场流通最多和临床应用最广泛的物种。P. polyphylla var. yunnanensis的化学成分多样，包括甾体皂苷、C21类固醇、五环三萜、蜕皮甾酮、黄酮类化合物以及其他成分（如多糖、氨基酸、β-蜕皮酮、脂肪酸等）[2]。P. polyphylla var. yunnanensis的药用部分是根茎，而地上部分的茎和叶通常被视为非药用部分。研究表明，其茎和叶的年生长量是根茎的7-8倍。鉴于野生资源的濒危状况，开发地上部分以实现资源的充分利用已成为亟待解决的问题[3]。然而，目前对其地上部分的研究仍然不足，特别是在能够直接反映药理作用的生物表型评估方面，这限制了对其药用价值的深入探索。通过长期观察，我们发现P. polyphylla var. yunnanensis的茎颜色存在显著的自然变异，以紫红色为主，但也存在绿色和淡紫色的个体。植物表型是其内在次生代谢物外部表现的综合体现，黄酮类化合物是调节这些表型特征形成的关键代谢基础。黄酮类化合物作为植物中广泛分布的多酚活性成分，具有生态调节和生理防御的双重功能。一方面，黄酮化合物是决定植物器官颜色表型的关键色素因子；另一方面，它们参与植物应激反应的调节，其含量的动态变化与抗病性和耐紫外线等生理特性直接相关[4]。黄酮类化合物具有广泛的生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗癌和神经保护作用[5]。因此，通过分析植物表型与黄酮积累之间的内在关系，不仅可以揭示植物的生理状态和环境适应性，还能为活性成分的表型导向筛选和优质种质资源的评估提供科学依据。同时，这也填补了P. polyphylla var. yunnanensis茎色表型与质量形成之间关联的研究空白，为“变废为宝”和提高资源利用效率提供了有效途径。此外，这也是解决其资源供需不平衡的关键策略。

甾体皂苷是P. polyphylla var. yunnanensis的核心生物活性成分。迄今为止，已从该植物中分离出72种甾体皂苷，主要为异螺甾烷醇类型，其中diosgenin和pennogenin为主要皂苷元。然而，根茎中主要含有diosgenin[6]。在P. polyphylla var. yunnanensis的根茎中鉴定出222种化合物，其中包括77种异螺甾烷醇类型皂苷[7]。Polyphyllin I、II和VII被列为2025年版《中国药典》中的质量控制指标。Polyphyllin I通过调节细胞周期、诱导自噬、促进细胞凋亡、逆转药物耐药性、增强肿瘤对化疗药物的敏感性以及调节肿瘤微环境等机制，表现出广谱抗肿瘤作用[8]。Polyphyllin II可显著提高P53和Bax蛋白的水平，在MCF-7细胞中诱导细胞凋亡，并调节细胞周期停滞，具有潜在的抗癌作用[9]。另一项研究发现，Polyphyllin VII在体外和体内均能选择性地抑制多发性骨髓瘤细胞的生长[10]。因此，将Polyphyllin I、II和VII作为P. polyphylla var. yunnanensis的质量评价指标具有重要意义。从代谢网络的角度来看，黄酮类化合物和皂苷共享上游的苯丙素类次生代谢途径，在生理调节网络中存在密切的竞争或协同关系。植物的生长发育过程及其对环境压力的响应会动态改变这两种代谢物在不同器官中的积累和分布模式。这种代谢分流机制导致不同部位活性成分的比例发生显著波动，从而直接影响药效的强度和质量稳定性。这表明，深入研究黄酮类化合物和皂苷的组成特征是理解地上部分表型多样性和皂苷介导的药效质量形成的基础。

由于中药成分极其复杂，对分析技术的要求非常高。光谱技术凭借其快速、全面和准确的定性和定量分析能力，已成为深入分析复杂化学系统及其物质基础不可或缺的核心工具。光谱分析可以提供有关中药化学成分官能团的信息，结合不同的光谱数据有助于全面研究这些草药的总体化学特性[11]。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）在植物代谢物研究方面取得了显著进展。利用LC-MS/MS鉴定和量化不同水果物种中的黄酮类化合物，并获取有关其生物利用度和代谢过程的重要信息，不仅提高了分辨率，缩短了分析时间，还实现了黄酮混合物的高通量分析[12]。高效液相色谱（HPLC）是目前常用的含量测定方法，具有选择性高、分离效率高和应用范围广等优点。此外，傅里叶变换红外（FT-IR）光谱结合机器学习技术用于鉴定Atractylodes chinensis和Atractylodes japonica的物种，通过HPLC指纹图谱结合化学计量学分析鉴定了5种不同的化学标记物。这种FT-IR与HPLC相结合的方法为Atractylodes chinensis的鉴定提供了可靠且易于解释的解决方案[13]。现代分析技术提供了强大的解决方案，但单一方法往往难以解决多种问题。因此，结合多种分析方法是解决当前问题的关键。本研究首先采用ATR-FTIR光谱技术分析了P. polyphylla var. yunnanensis不同表型部位的光谱特征，快速获得了与化学成分相关的官能团信息，随后利用LC-MS/MS技术进行了全面分析，深入探讨了导致表型差异的关键黄酮类代谢物。最后，使用HPLC准确测定了九种关键活性成分，并结合三种质量控制指标构建了PLSR模型，全面评估了两种表型之间的质量差异，建立了快速的含量预测方法。

样本采集与处理

为了确保地上部分活性成分含量最高且不发生萎蔫，本研究于2024年9月初从云南省曲靖市石宗县的一个标准化种植基地（坐标：N22°33′18″, E104°4′50″）采集了30株五年生的人工栽培P. polyphylla var. yunnanensis植物，包括绿茎和紫茎两种表型。该地区海拔1650.70米，属于亚热带季风气候，年平均气温为18°C。

ATR-FTIR光谱分析

我们收集了P. polyphylla var. yunnanensis两种表型不同部位的ATR-FTIR光谱，如图2所示。两种表型不同部位的吸光度存在一定差异，但吸收峰的位置和形状略有不同。为了更直观地观察两种表型之间的差异，我们将ATR-FTIR光谱的特征峰数据整理成表格，详细信息见

讨论

P. polyphylla var. yunnanensis是一种多年生草本植物，可在100至3500米的多种海拔范围内生长，适应森林、竹林、灌木丛和湿润草地等多种生境。它喜欢阴凉的环境，但避免积水。现代药理学研究表明P. polyphylla var. yunnanensis具有多种治疗作用，包括抗肿瘤、抗菌、抗炎和抗病毒作用

结论

本研究利用ATR-FTIR光谱技术对P. polyphylla var. yunnanensis两种茎色的不同部位进行了化学表征。结果显示，两种表型不同部位的光谱特征峰相似。根据吸光强度，确定了关键峰，这些特征峰表明不同部位富含黄酮类、多酚类和萜类等次生代谢物

作者声明

马慧：概念提出、研究、撰写-初稿。朱新燕：研究、方法学、撰写-审阅与编辑。王元中：概念提出、方法学、撰写-审阅与编辑

作者贡献声明

马慧：撰写-初稿、研究、概念提出。朱新燕：撰写-审阅与编辑、方法学、研究。王元中：撰写-审阅与编辑、方法学、概念提出。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金的资助[资助编号：32460099]。