《Journal of Chromatography A》：Green Ultrasound-Assisted Extraction of Flavonoids from Scutellariae Radix Using Deep Eutectic Solvents: A Hybrid BBD-ANN-GA Optimization Strategy and Mechanistic Insights
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超声辅助深共熔溶剂提取丹参根中黄酮类化合物，通过响应面法、人工神经网络和遗传算法优化工艺，最高提取率达194.03 mg/g，重复提取5次后仍保持高效率，红外和核磁共振证实溶剂结构稳定，量子化学计算揭示氢键和轨道相互作用为提取主因。
胡秋月|齐若晨|冯新娣|金电|孙莉|曾佐翔|梁峰|熊忠立|刘振
华东理工大学化学工程学院，上海，200237，中国
摘要
深度共晶溶剂（DESs）作为一种环保的替代品，已成为从药用植物中可持续提取生物活性化合物的理想选择，相比传统有机溶剂具有明显优势。本研究采用基于深度共晶溶剂的提取体系，并结合超声波辅助技术，从黄芩根（Scutellariae Radix，简称SR）中提取黄酮类化合物。通过结合Box-Behnken设计（BBD）、人工神经网络（ANN）建模和遗传算法（GA）的混合优化策略，实现了提取效率的最大化。在优化条件下，预测的黄酮类化合物产率为194.58毫克/克，与实验值（194.03毫克/克）非常接近。纯化的深度共晶溶剂提取物表现出较强的抗氧化活性。经过五次连续提取循环后，该溶剂的结构稳定性得以保持，提取率仅下降了11.39%。对固体提取残渣的表征表明，深度共晶溶剂破坏了黄芩根的微观结构，从而促进了黄酮类化合物的释放。基于量子化学计算的机理研究表明，深度共晶溶剂与黄酮类化合物之间的强氢键和轨道相互作用是提取过程的关键因素。这些结果证明了深度共晶溶剂作为可调且可重复使用的提取介质在天然产物提取方面的潜力，得到了实验数据和分子水平研究的共同支持。
引言
黄芩（Scutellaria baicalensis）属于唇形科（Lamiaceae）的多年生草本植物，在中医中有着悠久的应用历史。它以清热、燥湿、解毒和止泻的功效而闻名[1]。黄芩根（SR）富含4'-脱氧黄酮类化合物，如黄芩苷（baicalein）、黄芩素（baicalin）及其苷类，这些成分被认为是其主要生物活性成分[2]。现代药理学研究表明，黄芩根提取物具有多种生物活性，包括抗病毒、抗肿瘤、抗菌、抗氧化、保肝和神经保护作用[3][4][5]。在癌症治疗中，黄芩素可通过诱导细胞周期停滞和凋亡来抑制癌细胞增殖和转移[6]；吴茱萸苷（wogonoside）通过调节磷脂 scramblase 1的表达和核定位发挥抗肿瘤作用[7]；而黄芩苷则通过调控Hippo信号通路抑制乳腺癌细胞的生长[8]。这些发现为黄芩素及相关黄酮类化合物从传统草药应用向现代临床实践的转化奠定了坚实基础[9]。
深度共晶溶剂（DESs）由Abbott等人于2003年首次提出[10]，是一类通过氢键受体（HBAs）和供体（HBDs）之间的氢键作用形成的新型绿色溶剂。由于其低挥发性、可生物降解性和可调的物理化学性质，深度共晶溶剂作为天然产物提取介质受到了越来越多的关注。最新研究表明，优化后的深度共晶溶剂辅助超声波提取（DES-UAE）技术能够显著提高生物活性成分的提取效率（例如，相比乙醇和水等传统溶剂，提取效率可提高3.3倍[11]。这一高效性已在多种应用中得到验证，例如从艾叶（Artemisiae Argyi Folium）中提取黄酮类化合物[12]。此外，深度共晶溶剂-脂肪酸双相系统能够同时提取不同极性的植物化学物质，并实现相分离的切换[13]。通过开发可切换的深度共晶溶剂（SDESs），可以利用外部驱动力实现相变的可逆性，进一步提升提取过程的可持续性[14]。除了提高提取效率外，深度共晶溶剂还被证明能够保持甚至增强植物来源化合物的生物活性。例如，从覆盆子中提取多酚时，氯化胆碱-果糖深度共晶溶剂体系显示出比乙醇提取更强的抗氧化活性[15]；同样，从咖啡渣中提取时，深度共晶溶剂提取的提取物显示出比传统乙醇或水提取物高约十倍的抗菌活性[16]。
基于深度共晶溶剂的超声波辅助提取（DES-UAE）技术结合了深度共晶溶剂的环保特性和超声波增强的传质能力。超声波产生的空化作用和机械力有助于破坏植物细胞壁，加速细胞内生物活性化合物的释放、扩散和溶解[17]。人工神经网络（ANN）作为一种数据驱动的机器学习模型，被广泛应用于复杂非线性系统的建模和优化[18]。与传统机理模型相比，数据驱动的ANN更能捕捉多个过程参数与提取效率之间的复杂关系[19]。近年来，ANN在天然产物提取领域得到广泛应用，用于预测和优化植物来源生物活性化合物的产量[20,21]。遗传算法（GA）是一种受自然选择原理启发的进化优化工具，通过选择、交叉和变异等操作迭代生成最优解[22]。ANN-GA混合策略能够动态优化神经网络结构和算法参数，以适应特定问题需求，从而提高预测性能和鲁棒性[23,24]。
本研究开发了一种基于深度共晶溶剂的超声波辅助提取方法，用于从黄芩根中提取三种黄酮类化合物。目标化合物的化学结构见图S1。通过结合Box-Behnken设计（BBD）、ANN和GA的混合策略对提取过程进行了优化。粗提物经过大孔树脂纯化后，进一步评估了其生物活性。通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和核磁共振（NMR）分析，评估了所选深度共晶溶剂的重复使用性和结构稳定性。通过静电势（ESP）分析、基于Hirshfeld分配的独立梯度模型（IGMH）、前线分子轨道（HOMO-LUMO）计算和密度泛函理论（DFT）阐明了提取机制。本研究结合机器学习参数优化和计算机理解释，为开发可持续的植物来源生物活性化合物提取技术提供了新的视角。
材料
左旋丙酮酸（LeA）、L-(-)-苹果酸（LMA）、L-(+)-乳酸（LLA）、D-山梨醇（DS）、D-(-)-果糖（DF）、L-(+)-酒石酸（LTA）、木糖醇、柠檬酸（CA）、蔗糖、D-(+)-葡萄糖（DG）、L-脯氨酸（LP）以及纯度≥98.5%的吴茱萸苷标准品均购自上海D&B生物科技有限公司。氯化胆碱（ChCl）、甘油、己酸（HXA）、庚酸（HPA）、辛酸（OTA）购自上海Aladdin生化科技有限公司。
深度共晶溶剂的制备及初步提取
大多数合成的深度共晶溶剂呈无色透明状，仅有少数呈淡黄色。相比之下，相应的提取物显示出多种颜色（见图2a和2b）。根据2020版《中国药典》的规定，黄芩根提取物的颜色应介于浅黄色至黄褐色之间。实验结果表明，提取物的颜色强度与提取效率呈正相关，即黄酮类化合物含量越高的提取物颜色越深。
结论
本研究成功开发了一种绿色高效的超声波辅助深度共晶溶剂提取系统，用于从黄芩根中回收黄酮类化合物。在20种合成的深度共晶溶剂中，ChCl-LeA（1:2）混合物（含20%水分）的提取效率最高。通过结合Box-Behnken设计（BBD）、人工神经网络（ANN）和遗传算法（GA）的混合策略优化了提取过程。在优化条件下，黄酮类化合物的提取产量达到194.03毫克/克。纯化的提取物表现出良好的生物活性...
作者声明
胡秋月：撰写初稿、实验设计、数据处理。齐若晨：结果验证。冯新娣：方法学研究、文本撰写与编辑。金电：方法学研究。孙莉：资金筹集。曾佐翔：资源协调。梁峰：资源准备。熊忠立：资源协调。刘振：项目管理、文本撰写与编辑。
提供了化合物结构、高效液相色谱（HPLC）色谱图和Box-Behnken设计实验结果的详细信息。
作者贡献声明
胡秋月：撰写初稿、实验设计、数据处理。
齐若晨：结果验证。
冯新娣：文本撰写与编辑、方法学研究。
金电：方法学研究。
孙莉：资金筹集。
曾佐翔：资源协调。
梁峰：资源准备。
熊忠立：资源协调。
刘振：文本撰写与编辑、项目管理。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢华东理工大学提供的先进计算资源支持。
