通过晶体工程方法研究诺氟沙星的溶解性及其抗利什曼原虫（无鞭毛体期和前鞭毛体期）活性

《Journal of Molecular Structure》：Probing Solubility and Anti-leishmanial (amastigotes and promastigotes) Ability of Norfloxacin via Crystal Engineering Approach

诺氟沙星通过共晶化技术制备两种新型共晶（2和3），显著提升水溶性和pH依赖性溶解能力，体外实验显示对利什曼原虫（L. major和L. tropica）的抑制活性优于原药及标准药物，且对L. donovani具有中度活性，细胞实验和AFM分析验证了共晶在抑制原虫内吞阶段的潜力。

　　

乌鲁吉·伊克巴尔（Urooj Iqbal）、M. 伊克巴尔·乔杜里（M. Iqbal Choudhary）和萨默·优素福（Sammer Yousuf）

巴基斯坦卡拉奇大学国际化学与生物科学中心H.E.J.化学研究所，卡拉奇75270

摘要

诺氟沙星属于IV类抗生素，其特点是水溶性差且膜通透性低。通过采用回流法制备了两种诺氟沙星的共晶体（2-3），以研究共结晶对杀利什曼原虫效果和溶解度的影响。利用X射线晶体衍射分析以及红外光谱和差示扫描量热/热重分析（DSC/TGA）对新的共晶体进行了表征。结果表明，共晶体2和3在pH值为6.8和7.4的水溶液及溶解介质中的溶解度显著提高。体外实验显示，这些共晶体对L. major的游动子（细胞外阶段）具有良好的抑制作用，其IC₅₀值分别为7.54 ± 0.01 μM和9.63 ± 0.02 μM，而原始药物1的IC₅₀值为11.22 ± 0.05 μM，标准药物米替福辛（Miltefosine）的IC₅₀为31.8 ± 0.2 μM，戊胺嘧啶（Pentamidine）的IC₅₀为9.23 ± 0.01 μM，两性霉素B（Amphotericin B）的IC₅₀为3.39 ± 0.01 μM。对于L. tropica的游动子（细胞外阶段），化合物2和3的IC₅₀值分别为10.92 ± 0.05 μM和6.44 ± 0.02 μM，而原始药物1的IC₅₀为15.44 ± 0.04 μM，标准药物米替福辛的IC₅₀为27.2 ± 0.6 μM，戊胺嘧啶的IC₅₀为9.22 ± 0.01 μM，两性霉素B的IC₅₀为3.34 ± 0.01 μM。原始药物对L. donovani无效，但两种共晶体（2-3）显示出中等活性，其IC₅₀值分别为59.6 ± 0.07 μM和44.2 ± 0.09 μM，与标准药物米替福辛（IC₅₀为22.2 ± 0.01 μM）、戊胺嘧啶（IC₅₀为9.25 ± 0.02 μM）和两性霉素B（IC₅₀为3.38 ± 0.01 μM）相比。基于J774.2细胞系（鼠巨噬细胞）的感染实验以及原子力显微镜（AFM）分析进一步证实了共结晶对L. major中利什曼原虫（细胞内/巨噬细胞内阶段）生长的抑制作用。这些结果表明，共结晶显著提升了诺氟沙星的抗利什曼作用和水溶性，这是首次此类研究。

引言

晶体工程和超分子化学为解决固态药物制剂中的溶解性问题提供了有效策略，通过合理设计晶体晶格内的非共价相互作用来实现[1,2]。了解氢键、分子间力和分子堆积方式，制药科学家能够设计出能够调整活性药物成分（API）物理化学性质的稳健超分子结构[3]，以满足特定治疗需求[4]。近年来，药物共结晶技术受到了广泛关注，因为它可以在不改变药物分子内在共价结构或药理活性的前提下，改善其溶解度、渗透性、溶解速率和吸湿稳定性等关键性质[5,6]。药物共晶体定义为由两种或更多不同分子或离子成分按固定化学计量比组成的结晶态单相材料，既不是简单的盐也不是溶剂化物[7]。通过选择互补的功能基团，晶体工程可以形成多种固态形式，包括多晶型、溶剂化物、形态改良的晶体和共晶体[8],[9],[10],[11]。共晶体已成为提高难溶性药物生物药理特性的有效方法，具有提高溶解度、溶解速率、流动性、压缩性、化学稳定性和整体物理稳定性的优势[6,12,13]。Hirshfeld表面分析结合量子分子理论（QT-AIM）等分析工具能够可视化并量化非共价相互作用，揭示氢键和其他分子间接触如何稳定晶体结构（Bakheit, Attwa, Kadi, Ghabbour, & Alkahtani, 2023）。

本研究应用晶体工程技术改进诺氟沙星的生物药理性能。诺氟沙星是一种BCS IV类第一代氟喹诺酮类抗生素，1984年获得美国FDA批准。其化学名称为1-乙基-6-氟-1,4-二氢-4-氧-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸[14]，对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌有效，临床用于治疗淋病、尿路感染、呼吸道感染和前列腺炎[15,16]。除了抗菌作用外，氟喹诺酮类药物（包括诺氟沙星）还显示出作为抗利什曼原虫药物的潜力。Romero等人[17]证明第二代氟喹诺酮类药物对Leishmania (Viannia) panamensis的细胞内游动子具有选择性作用，Omran等人[18]报告称诺氟沙星显著降低了Leishmania donovani游动子的活性。尽管诺氟沙星具有治疗潜力，但其临床应用受到水溶性差、口服生物利用度低（约30%）和中等蛋白结合能力的限制（约15%）。其溶解度高度依赖于pH值，因为羧酸基团与哌嗪环之间的质子转移会在等电点形成两性离子结构，这虽然提高了溶解度，但也降低了膜通透性，从而影响了口服吸收。

此外，诺氟沙星在水或潮湿条件下极易吸水，容易形成多种水合物晶体。文献中报道了其二水合物、三水合物、五水合物和半水合物等多种形式，每种形式的水分子比例不同。这种吸水倾向增加了固态稳定性方面的复杂性，进一步限制了制剂开发。Gunnam和Nangia[14]开发了诺氟沙星与甲基对羟基苯甲酸、乙基对羟基苯甲酸、甲磺酸等共晶体的合成。通过SCXRD、PXRD、DSC、TGA和FTIR等手段对这些晶体形式进行了表征，结果显示，与相应水合物相比，甲磺酸和苯磺酸形成的无水离子形式的溶解度和溶解速率显著提高（Gunnam, Nangia, & Design, 2023）。Gomes等人（2023）通过溶剂蒸发技术制备了诺氟沙星与异烟酰胺（INA）的溶剂化物共晶体，晶体学表征和溶解度研究显示其水溶性提高了8.38倍，溶解速率提高了1.8倍，证明了共结晶在改善诺氟沙星生物药理性质方面的潜力（Gomes et al., 2023）。

本研究采用晶体工程策略，通过形成药物共晶体来优化诺氟沙星的物理化学性质。本研究的主要目标是提高其溶解度，并探索其对利什曼原虫活性的潜在改善作用，从而克服其主要生物药理限制。

材料与方法

诺氟沙星（CAS编号70458-96-7，纯度98.0%）从东京化学工业有限公司（日本）购买；2-磺基苯甲酸（CAS编号632-25-7，纯度98%）和5-羟基-2-硝基苯甲醛（CAS编号42454-06-8，纯度98%）从Sigma Aldrich（德国）购买，无需额外纯化即可使用。用于生长晶体的溶剂为DCM和甲醇（HPLC级，Sigma Aldrich德国）。

共晶体的合成

诺氟沙星（1）与选定的共形成分通过回流法进行共结晶

共晶体的合成

诺氟沙星1分别与2-磺基苯甲酸4（共晶体2，配比2:1，方案1）和5-羟基-2-硝基苯甲醛5（共晶体3，配比1:1，方案2）按2:1和1:1的化学计量比进行共结晶，溶剂为HPLC级甲醇和DCM（方案1，方案2）

结构特征

X射线衍射数据显示，诺氟沙星晶体属于三斜晶系，空间群为P-1，羧酸官能团位于喹啉环同一平面上，而哌嗪环呈典型的椅式构象[30]。两种共晶体（2和3）均属于三斜晶系P-1空间群，且诺氟沙酸与2-磺基苯甲酸的化学计量比仍保持为2:1

结论

本研究采用回流法成功将水溶性差、膜通透性低的BCS IV类抗生素诺氟沙星转化为两种新型共晶体（2和3）。单晶X射线衍射、DSC/TGA和红外光谱等结构及物理化学表征证实了新晶体的形成。与原始药物相比，这两种共晶体在pH值为6.8和7.4的水溶液中的溶解度显著提高。

未引用的参考文献

[[31], [32], [33]]

CRediT作者贡献声明

乌鲁吉·伊克巴尔（Urooj Iqbal）：撰写初稿、软件开发、实验设计、数据分析。M. 伊克巴尔·乔杜里（M. Iqbal Choudhary）：审稿与编辑、项目监督、资源协调、概念构思。萨默·优素福（Sammer Yousuf）：审稿与编辑、数据验证、项目监督、资金筹集、数据管理、概念构思。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究的部分资金由HEC提供，项目名称为“开发基于药用植物的外用制剂以治疗皮肤利什曼病——这一被忽视的热带疾病，也是巴基斯坦的主要经济负担之一”。项目编号：TDF04-071