《Cells》：Spatial Protein Expression Analysis in Lungs Using Capillary-Based Immunoassay After Laser-Assisted Microdissection
Stefan Hadzic,
Marija Gredic,
Vanessa Nebel,
Norbert Weissmann and
Cheng-Yu Wu
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为克服传统Western Blot在低丰度蛋白及微量样本空间表达验证中的局限，本研究建立了激光捕获显微切割（LMD）与自动毛细管电泳免疫分析（CEI）联用的工作流程，实现了在肺组织内空间特异性区域（如肺泡、血管）进行高灵敏、定量的蛋白质分析。该方案成功应用于香烟烟雾（CS）诱导的小鼠肺损伤模型，证实了内皮细胞标志物PECAM1在肺泡区的下调及p38 MAPK信号通路的激活。此方法为空间转录组/蛋白质组数据的正交验证提供了有力工具，并有望用于复杂器官疾病机制研究与治疗靶点识别。
肺作为人体与外界气体交换的门户，结构精妙而复杂，但同时也持续暴露于香烟烟雾、空气污染物等有害环境因素之中。当肺的自我修复机制受损时，便会引发慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化等多种疾病。然而，肺部的病理改变并非均匀发生，而是在特定的、离散的微区域（micro-niches）内悄然进行，比如某个血管段或一小簇肺泡。这就对传统的研究方法提出了巨大挑战：当我们把整个肺组织研磨成匀浆进行“批量分析”时，获得的是一个“平均”的结果，那些关键但在局部发生的微弱信号——比如特定细胞类型的减少或某个信号通路的异常激活——很容易被大量“背景噪音”所淹没。为了“看清”疾病在特定位置的分子细节，科学家们需要一把能在复杂组织中“精准取样”的手术刀，并对取出的微量样本进行“高灵敏检测”。
激光捕获显微切割（LMD）就是这样一把“分子手术刀”，它允许研究者在显微镜下精确地切割并收集特定形态的区域，如单个肺泡壁或一段小血管，从而保留了宝贵的空间位置信息。然而，过去基于LMD的研究大多局限于转录组分析，而基因的转录水平与最终的蛋白质表达水平未必总是一致。更重要的是，蛋白质的翻译后修饰（如磷酸化）是调控细胞功能的关键开关，无法通过检测mRNA来获知。传统的Western Blot（WB）虽然能用于蛋白质检测，但其所需样本量大、操作繁琐，对LMD获取的微量样本往往“力不从心”。
针对这一难题，一项发表在《Cells》上的研究提出并验证了一套创新的“组合拳”方案。研究人员将LMD的“精准定位”能力，与一种名为自动毛细管电泳免疫分析（CEI）的“微量检测”技术相结合。CEI技术所需蛋白上样量极低（仅需纳克级），是传统WB的数千分之一，且自动化程度高、重复性好，完美匹配了LMD样本“量少而珍贵”的特点。通过这套名为LMD-CEI的工作流程，研究人员得以首次在肺组织复杂的空间结构背景下，对特定区域的蛋白质表达进行灵敏、定量的分析。
本研究的关键技术方法主要包括：研究人员使用了一个慢支香烟烟雾（CS）暴露8个月的小鼠模型（每组n=8）。他们通过标准化的肺部灌注与膨胀固定流程，制备了用于LMD的冷冻切片和用于验证的福尔马林固定石蜡包埋切片。利用LMD技术，他们从肺切片中精确分离了支气管、肺血管和肺泡隔等目标区域。随后，通过自动毛细管电泳免疫分析（CEI）对收集的微量样本进行靶向蛋白质（如α-SMA、Pro-SFTPC、PECAM1、磷酸化p38等）的定量检测，并使用总蛋白进行上样量归一化。同时，利用免疫荧光染色和共聚焦显微镜成像对蛋白质的空间分布进行可视化验证，以确认LMD-CEI结果的可靠性。
3.1. 小鼠肺组织取样用于空间蛋白质表达分析
为了确保下游区域识别和显微切割的准确性，维持样品制备过程中的生理压力（血管灌注和肺部膨胀）至关重要。研究人员建立了标准化的操作流程：在安乐死后，通过肺动脉进行血管灌注以清除血液，随后对左肺叶采用两种处理方法——福尔马林固定后进行石蜡包埋，或灌注O.C.T.化合物后进行冷冻切片。这一标准化的组织处理方法保障了肺组织结构的完整性，为后续精确的LMD提供了基础。
3.2. 验证基于LMD的空间蛋白质表达分析
研究首先通过免疫荧光染色明确了α-SMA、Pro-SFTPC和PECAM1等细胞标志物在肺组织中的空间分布模式。接着，他们从健康小鼠肺冷冻切片中，利用LMD分别收集了支气管、肺血管、肺泡隔区域以及整张切片（作为对照），并利用CEI进行蛋白定量。结果令人信服地显示：α-SMA蛋白水平在支气管和血管中显著富集；Pro-SFTPC蛋白高度富集于肺泡隔；PECAM1蛋白则在肺血管和肺泡隔中富集，但在支气管中不表达。这些数据与免疫荧光观察到的信号分布模式完全吻合，证实了LMD富集的高度特异性，并验证了整个工作流程能够作为一种快速、灵敏、准确的空间特异性蛋白定量工具。
3.3. 在临床前与转化研究中的潜在应用
为了展示该方法在疾病建模中的应用价值，研究将其应用于一个慢性CS诱导的肺损伤小鼠模型。在先前的研究中，转录组分析发现CS暴露小鼠的内皮型一氧化氮合酶表达下调，免疫荧光计数也显示内皮细胞减少。本研究利用LMD-CEI工作流程，在CS暴露小鼠LMD富集的肺泡隔区域，独立地验证了内皮细胞标志物PECAM1蛋白水平的显著下调。这一结果与此前观察到的肺气肿中毛细血管稀疏化现象一致。此外，研究还发现CS暴露小鼠LMD富集的肺血管中，p38 MAPK的磷酸化水平显著升高，进一步支持了该模型中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的激活。这些实例表明，该工作流程能够作为验证转录组学发现、探究肺损伤与修复过程中细胞/组织特异性蛋白丰度与翻译后修饰的有效工具。
研究结论与意义
本研究建立并验证了一套结合激光捕获显微切割与自动毛细管电泳免疫分析的空间蛋白质表达分析方案，成功解决了传统WB因样本量需求大而无法对空间限定区域进行蛋白定量的难题。该方法具有高灵敏度与特异性，能够在结构复杂的肺组织中，精准量化肺泡、血管等不同区域的细胞类型特异性蛋白标志物及其翻译后修饰水平（如磷酸化）。其在CS诱导肺损伤模型中的应用，不仅从蛋白层面验证了肺泡区域的内皮细胞减少（PECAM1下调），还揭示了肺血管中p38 MAPK信号通路的激活，为理解慢性阻塞性肺疾病等肺部疾病的发病机制提供了新的分子视角。
讨论部分进一步阐述了该工作流程的独特优势与潜在价值。相比于目前主流的空间蛋白质组学平台（如NanoString GeoMx、CODEX、成像质谱流式等），LMD-CEI工作流程的仪器门槛相对较低，更适合在常规实验室中开展针对性的蛋白靶标验证。它能以极低的蛋白上样量（纳克级）实现稳定、可重复的定量，尤其适用于蛋白质产量本就很有限的LMD衍生样本。该工作流程未来可通过多重检测进一步扩展应用，结合人工智能辅助图像分析提高效率，并有望推广至其他结构复杂的器官或疾病模型，用于验证空间转录组/蛋白质组学数据、识别生物标志物、绘制信号通路改变图谱，从而推动对疾病病理机制的深入理解和潜在治疗靶点的发现。
