在优化溶剂条件下，超声波辅助提取与水动力空化法在从柠檬副产品中回收酚类物质方面的比较评估 Gabriele Ballistreri, Ignazio Maria Gugino, Martina Papa, Michele Canale

《Foods》：Comparative Evaluation of Ultrasound-Assisted Extraction and Hydrodynamic Cavitation Under Optimized Solvent Conditions for Phenolic Recovery from Lemon By-Products Gabriele Ballistreri, Ignazio Maria Gugino, Martina Papa and Michele Canale

　　摘要
芽孢杆菌和类芽孢杆菌属微生物在食品系统中普遍存在且分布广泛，常与食品变质和质量问题相关。特别是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），已被证实会导致调味食品中产生气体和包装膨胀。本研究开发了一种基于重组酶聚合酶扩增（RPA）技术与CRISPR/Cas12a技术结合的快速可视化检测方法（称为RPA-CRISPR/Cas12a）。根据枯草芽孢杆菌保守的gyrB基因设计了一对特异性RPA引物和探针。根据RPA扩增目标序列中的富T PAM位点数量制定了两组crRNA，并结合CRISPR/Cas12a转剪接检测技术优化了反应条件。在最优条件下，含有丰富TTPAM位点的crRNA3显示出比含有丰富TTT位点的crRNA2更高效的切割效果，而含有丰富TTTTRPAM位点的crRNA1则没有活性。该方法在37°C下10分钟内可实现基因组DNA的检测限为150 pg/μL，细菌悬浮液的检测限为5.5 CFU/mL。该方法具有高特异性和灵敏度，为食品中枯草芽孢杆菌的早期现场检测提供了可靠的工具。

1. 引言
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种普遍存在的革兰氏阳性细菌，在食品工业中因其益生菌特性、酶生产以及在乳酸饮料生产和啤酒废弃物利用等发酵过程中的作用而受到重视。虽然通常被认为安全，但其厌氧代谢会导致调味食品和臭豆腐等产品的产气与变质，从而造成重大经济损失。这种双重特性凸显了开发快速准确检测方法的必要性。传统检测方法（如培养基方法、免疫分析和PCR）通常耗时、劳动强度高，且容易产生假阳性或假阴性结果。尽管拉曼光谱等新兴技术在检测细菌孢子方面显示出潜力，但仍需要更简单、更快、更可靠的检测平台，以便在现场应用同时保持高准确性。直接针对微生物核酸的分子生物学方法是当前最敏感且发展迅速的检测手段之一。其中，等温扩增技术具有高灵敏度、比实时定量PCR更简单的核酸制备过程，并能快速获得结果。对于具有高度保守同源序列的细菌物种的准确鉴定，基于16SrRNA和gyrB基因序列构建的系统树已被证明能有效区分解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）及其相关物种。多种基因（包括16SrRNA、rpoB、gyrA和gyrB）已被广泛用于芽孢杆菌属的检测和鉴定。然而，16SrRNA基因在芽孢杆菌属内序列相似度较高，难以区分密切相关的物种。相比之下，gyrB基因具有更大的物种间差异，已被验证为区分枯草芽孢杆菌与其近缘种的可靠系统发育标记。因此，本研究选择gyrB基因作为目标基因，该基因在不同属间具有保守区域，但在物种间具有足够的变异。利用这一目标的检测方法能够特异性识别枯草芽孢杆菌，而不会与其他致病菌发生交叉反应。

CRISPR是细菌和古菌中的适应性免疫系统，可防御病毒入侵。如今它已成为基因工程中的强大基因编辑工具，能够快速准确地识别和切割特定核酸序列以抵御移动遗传元件。Cas12a的发现促进了DETECTR和HOLMES等DNA检测方法的发展。Cas12a家族是一类由单个crRNA调控的核酸酶，能够特异性识别并切割含有Protospacer Adjacent Motif（PAM）辅助序列（5′-TTTN-3′或5′-TTN-3′）的dsDNA。当CRISPR/Cas12a在crRNA引导下靶向dsDNA时，也能切割ssDNA，使其成为dsDNA检测的特异性工具。PAM识别是识别和降解DNA分子的关键步骤，因为它使CRISPR/Cas系统能够区分自身基因组DNA和外来核酸。总之，CRISPR检测通过目标核酸激活Cas蛋白的转剪接活性来实现，从而切割荧光标记的探针，产生荧光信号，完成目标核酸的检测。将CRISPR/Cas12a与RPA结合可引入额外的序列特异性验证层，提高检测特异性并减少假阳性结果。

2. 材料与方法
2.1. 试剂和仪器
BS ATCC6633、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）LA10以及常见致病菌株（包括大肠杆菌EC-1、沙门氏菌S-31、副溶血性弧菌VP28、单核细胞增生李斯特菌LM16和金黄色葡萄球菌ATCC25922）均在实验室中保存。
TIANamp细菌DNA试剂盒（DP302，上海天根生化科技有限公司）；RPA基本等温扩增试剂盒（潍坊Amplfuture生物技术有限公司）；无核酸酶水；酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）DNA提取液（上海桑贡生物科技有限公司）；DNA级CTAB溶液；50× TAE缓冲液（上海桑贡生物科技有限公司）；琼脂糖；核酸凝胶染色剂；6× DNA加载缓冲液；无水乙醇；TranscriptMax T7高产RNA合成试剂盒（上海ToloBio生物技术有限公司）；LbCas12a（Cpf1）核酸酶（上海ToloBio生物技术有限公司）；HOLMES ssDNA报告基因（FAM，上海ToloBio生物技术有限公司）。当HOLMES ssDNA报告基因完整时，报告基因组发出的荧光信号被抑制；当探针被切割后，5′端的FAM报告基团与抑制剂分离，产生可检测的荧光信号。
恒温震荡器（上海冠森生物科技有限公司）；冷藏离心机（德国Eppendorf公司）；凝胶成像系统；恒温金属浴（杭州Bioer科技有限公司）；实时PCR系统；DYY-6D电泳仪（北京刘义仪器厂）；T6新世纪UV-Vis分光光度计（北京）；NanoDrop One超微量分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）。
2.2. 菌株活化与细菌培养
配制脑心浸液（BHI）培养基（200 mL），并在高压灭菌锅中121°C下灭菌20分钟。初次活化时，将-80°C保存的200 μL枯草芽孢杆菌菌株接种到5 mL培养基中，置于37°C下180 rpm震荡培养6小时；次日将初级培养物转移到5 mL新鲜培养基中，继续在37°C下180 rpm培养过夜（12小时），然后离心13,000× g 3分钟收集细菌细胞。按照制造商说明使用DNA提取试剂盒（柱型）提取基因组DNA，通过NanoDrop One超微量分光光度计测量DNA浓度（A260/A280比值在1.8至2.2之间）。提取的DNA在-20°C下保存备用。
通过平板菌落计数测得枯草芽孢杆菌悬浮液的浓度为5.5 × 10^9 CFU/mL。将菌液系列稀释至所需浓度（范围为5.5 × 10^6 CFU/mL至5.5 CFU/mL）。采用煮沸法提取DNA以检测其敏感性：每种稀释后的菌液离心13,000× g 1分钟，弃去上清液，加入100 μL无菌超纯水重新悬浮细菌沉淀，加热95°C 10分钟，立即离心≥13,000× g 10–15分钟，然后用移液管小心转移上清液至新的无菌1.5 mL离心管中，提取的DNA在-20°C下保存。
2.3. RPA和crRNA引物设计
利用美国国家生物技术信息中心（NCBI，网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库检索并比对枯草芽孢杆菌的目标基因序列，分析保守区域。根据识别的高度保守序列设计了特异性RPA引物，引物长度设定为30–35 bp，扩增目标片段长度控制在150–500 bp之间，以确保高效特异性扩增。引物设计过程中使用了连续重复序列和二级结构，全部通过Premier Biosoft软件（美国旧金山）完成。通过琼脂糖凝胶电泳确定最佳引物组合，具体引物组合见表S1。根据Cas12a识别的PAM位点特点设计了crRNA，这些PAM位点富含TTTN（N表示任意核苷酸）或TTTV（V = A/C/G）。设计了三种crRNA，针对gyrB基因的RPA扩增产物。引物和crRNA的设计考虑了两个关键因素：首先，crRNA序列必须靶向RPA扩增的保守区域，且长度不宜过长（一般200–300 bp为宜）；其次，crRNA序列不能与RPA引物重叠。最终选择的crRNA基于荧光曲线分析确定。所有引物由上海桑贡生物科技有限公司合成。合成后，根据TranscriptMax T7高产RNA合成和纯化试剂盒的说明将引物用于转录为crRNA。使用NanoDrop One超微量分光光度计测量合成crRNA的浓度（A260/A280比值在1.8至2.2之间）。crRNA被合成并稀释至工作浓度1 μM。设计了三种针对枯草芽孢杆菌的crRNA，每种crRNA均包含LbCas12a识别所需的保守20个核苷酸（nt）重复序列（UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU），后面跟着与枯草芽孢杆菌基因组互补的靶向特异性间隔序列。图1展示了RPA引物和crRNA的设计位置。
表1. 引物和crRNA的序列。
2.4. RPA-CRISPR/Cas12a检测方法
RPA扩增反应体系（50 μL）配制如下：向冻干粉管中依次加入29.4 μL A缓冲液、2 μL正向引物（10 μmol/L）、2 μL反向引物（10 μmol/L）、2 μL枯草芽孢杆菌基因组DNA和12.1 μL ddH2O，然后加入2.5 μL B缓冲液，混合均匀后离心。混合物在恒温金属浴中38–40°C下孵育15–30分钟。扩增完成后，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）混合物，以12,000 rpm离心3分钟纯化RPA产物。离心后的上清液含有纯化的RPA产物，通过2%琼脂糖凝胶电泳（AGE）进行分析。
CRISPR/Cas12a蛋白介导的切割反应体系（20 μL）包括：2 μL 10× Cas12a反应缓冲液、2 μL crRNA、1 μL Cas12a核酸酶（1 μM）、1 μL报告基因ssDNA（1 μM）、1 μL RPA扩增产物和13 μL无核酸酶水。整个体系在冰上制备。进行实时荧光定量检测时，将反应混合物混合均匀后离心，放入qPCR仪器中，37°C下进行40个循环，每30秒收集一次数据。
2.5. RPA-CRISPR/Cas12a检测条件的优化
使用转录的crRNA验证了检测系统的可行性。将1 μL RPA扩增产物加入CRISPR/Cas12a检测系统中，初步实验确认该方法能够检测枯草芽孢杆菌并鉴定有效crRNA。根据实验结果优化了检测体系中crRNA和Cas12a核酸酶的用量。RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的优化用于检测BS。
(A) RPA引物筛选的凝胶电泳。
(B) 通过荧光可视化、实时扩增和终点荧光来筛选crRNA。
(C) 引物-cRNA组合的优化。
(D) 最终优化系统的验证。数据为平均值±标准差（n = 3）。****表示p < 0.0001的统计学显著差异。
crRNA（1 μM）剂量筛选：测试了不同体积的crRNA：0 μL、1 μL、2 μL和4 μL。根据荧光曲线和强度确定最佳的crRNA剂量。
Cas12a（1 μM）蛋白剂量筛选：测试了不同体积的Cas12a蛋白：0 μL、1 μL、2 μL和4 μL。根据荧光曲线和强度确定最佳的Cas12a剂量。

制备完成后，将反应混合物混合，短暂离心后立即转移到实时荧光PCR仪器中。反应在37°C下进行40个循环，每30秒收集一次信号。根据qPCR荧光曲线获得的荧光值选择最佳的crRNA和Cas12a蛋白剂量。
反应温度：根据最佳的RPA反应条件和系统，测试了五种CRISPR/Cas12a检测的温度：5°C、25°C、37°C和45°C。CRISPR反应时间设定为10分钟，使用无核酸酶的水作为空白对照。
反应时间：根据最佳的RPA反应条件和系统，测试了六种CRISPR/Cas12a检测的反应时间：5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟和40分钟。CRISPR反应温度设定为37°C，使用无核酸酶的水作为空白对照。

2.6 RPA-CRISPR/Cas12a检测系统的特异性评估
基于优化的RPA-CRISPR/Cas12a检测反应温度和时间，使用荧光检测方法评估了crRNA的特异性。使用了来自七个代表性菌株的基因组DNA，包括BS、与其密切相关的Bacillus cereus以及几种常见的食源性病原体，如大肠杆菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌。
其中，Bacillus cereus被选为Bacillus属中系统发育上较接近的菌株，它经常出现在食品基质中，并且与BS具有高度的基因组相似性，因此是验证物种特异性的代表性和关键对照。其他菌株包括来自不同属的常见食源性病原体，以排除与无关微生物的交叉反应。这些菌株共同用于全面评估该检测方法对BS的靶向特异性。

2.7 RPA-CRISPR/Cas12a检测系统的灵敏度分析
评估了基因组DNA检测的灵敏度。将BS的纯化基因组DNA连续稀释10倍，得到150 ng/μL、15 ng/μL、1.5 ng/μL、15 pg/μL、15 pg/μL和150 fg/μL的浓度。这些稀释后的扩增产物被用作模板。
对于纯BS悬浮液的检测灵敏度，对对数生长期的培养物进行了连续10倍的稀释。通过煮沸法提取DNA，并用作RPA-Cas12a扩增的模板。将建立的方法的检测限和性能与GB/T 26428-2010 [19]中规定的“饲料中枯草杆菌的测定方法”以及GB 4789.2-2022 [20]国家食品安全标准“食品微生物检测： aerobic平板计数”中规定的通用微生物计数要求进行了比较。

定义检测限（LOD）为产生显著高于背景噪声的荧光信号的BS最低浓度。根据阴性对照（NEG）信号的标准差（SD），使用3σ规则（3σ）计算LOD：
LOD = MeanNEG + 3 × SDNEG
MeanNEG是阴性对照组的平均荧光值，SDNEG是相应的标准差。SD确定为10 RFU。此外，还对对数转换后的CFU/mL值和循环阈值（Ct）值进行了线性回归分析以建立标准曲线，并根据回归线与LOD阈值的交点验证了LOD。

2.8 凝胶电泳和荧光图像的定量分析
使用ImageJ 1.53k软件（美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）测量琼脂糖凝胶电泳图像上目标DNA条带的灰度强度，定量评估了RPA产物的扩增效率。对于基于荧光的检测，使用荧光定量PCR系统收集荧光信号，并用ImageJ进行类似分析。对于每个样本，在减去背景后计算平均灰度强度。相对扩增效率表示为归一化灰度强度或归一化荧光强度。使用GraphPad Prism 9.0软件（美国加利福尼亚州圣地亚哥）将量化数据绘制为条形图。所有实验均重复三次，数据以平均值±标准差表示。统计比较使用单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA），随后进行Tukey多重比较测试，****表示p < 0.0001。

2.9 统计分析
所有实验均重复三次（n = 3），具有独立的生物重复。数据以平均值±标准差表示。统计分析使用GraphPad Prism 9.0软件进行。对于不同组间（例如不同crRNA、引物组合）的荧光强度比较，使用单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）后进行Tukey多重比较测试以确定显著差异。p值< 0.05被认为是统计学上显著的，****表示p < 0.0001，***表示p < 0.001，**表示p < 0.01，*表示p < 0.05。

3. 结果
3.1 RPA和crRNA引物的设计及筛选
本研究选择gyrB基因作为检测目标，该基因在Bacillus属内具有高度保守性，但在物种间有足够的差异以区分密切相关的物种。建立的检测方法可以特异性地识别BS，且不与其他测试的细菌菌株发生交叉反应，包括常见的食源性病原体和密切相关的Bacillus cereus。
为了建立高度敏感和特异性的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法，我们首先优化了RPA引物对。如图2A所示，通过琼脂糖凝胶电泳初步筛选了六种引物组合（F1R1、F2R1、F3R1、F1R2、F2R2、F3R2）。其中，F1R1、F2R1、F3R1和F2R1产生了清晰的目标条带，而F2R2和F3R2显示出非特异性扩增或弱信号。基于条带的亮度和特异性，F2R1被选为后续实验的最佳RPA引物对。
使用在最佳反应时间15分钟下获得的RPA产物作为模板，筛选了用于CRISPR/Cas12a检测系统的crRNA。分别将crRNA1、crRNA2和crRNA3引入反应系统。图2B显示，crRNA1未观察到荧光信号，而crRNA3组的荧光强度高于crRNA2组。进一步对crRNA2和crRNA3进行了可行性测试。图2C、D表明只有当系统中同时存在crRNA和DNA时才会激活荧光。crRNA2和crRNA3都能检测到BS。

3.2 RPA反应条件的优化
反应温度设定为30°C、33°C、37°C、39°C、41°C和45°C，反应时间固定为20分钟。使用最佳引物对RPA-F2/R1通过RPA扩增BS的基因组DNA。通过测量AGE中目标条带的灰度强度定量评估扩增效率。如图3A、B所示，定量灰度分析确认39°C下的扩增效率显著高于37°C（p < 0.05），并且与41°C下的扩增效率相当，39°C下观察到的条带最一致且最亮。因此，39°C被选为该方法中RPA反应的最佳温度。

3.3 RPA检测方法的优化、特异性和灵敏度
(A,B) 通过凝胶电泳和灰度量化进行温度优化。
(C,D) 通过凝胶电泳和灰度量化进行时间优化。
(E) 对常见食源性病原体的特异性测试。
(F) 通过连续DNA稀释进行灵敏度评估。数据为平均值±标准差（n = 3），****表示p < 0.0001的统计学显著差异。M：DL2000 DNA标记；N：阴性对照。
为了优化RPA反应时间，分别在39°C的最佳温度下进行5分钟、10分钟、15分钟、20分钟和30分钟的扩增。通过测量AGE中目标条带的灰度强度定量评估扩增效率。如图3C、D所示，5分钟未观察到特异性扩增，而从10分钟开始出现清晰的目标条带。定量灰度分析确认10至15分钟间的扩增效率显著增加（p < 0.05），并在15分钟达到平台期，随后时间点（15–30分钟）条带亮度没有显著提高（p > 0.05）。因此，15分钟被选为平衡扩增效率和检测速度的最佳反应时间。
根据电泳图3E，BS显示出明显的扩增条带，而所有其他细菌菌株均显示阴性结果，表明RPA扩增与非目标菌株之间没有交叉反应，显示出高特异性。
在39°C和15分钟的最佳反应条件下，使用最佳引物对对BS的连续稀释基因组DNA进行了RPA-AGE检测。包括不含模板的阴性对照，使用ddH2O代替。如图3F所示，最低可检测浓度为10^-5 ng/μL，表明RPA扩增具有高灵敏度。

3.3 RPA-CRISPR/Cas12a检测系统的优化
如图4A、C所示，向20 μL检测系统中添加不同体积的crRNA（0 μL、1 μL、2 μL和4 μL）以优化crRNA剂量。优化基于所有实验中包含的无模板阴性对照的终点荧光强度的定量分析。结果显示，2 μL的crRNA获得了最高的荧光信号和最快的反应速率，尽管1 μL也能检测到可见荧光。

4. BS RPA-CRISPR/Cas12a检测系统的优化
(A) 不同crRNA添加量的筛选；
(B) 不同Cas12a添加量的筛选；
(E) 反应时间优化（5–40分钟）；
(F) 反应温度优化（5–45°C）。
对于crRNA2：
(C) 不同crRNA添加量的筛选；
(D) 不同Cas12a添加量的筛选；
(G) 反应时间优化（5–40分钟）；
(H) 反应温度优化（5–45°C）。所有荧光强度数据以平均值±标准差表示（n = 3）。****表示p < 0.0001的统计学显著差异。
基于选定的2 μL crRNA，进一步评估了不同体积的Cas12a蛋白（0 μL、1 μL、2 μL和4 μL）。如图4B、D所示，定量终点荧光分析确认crRNA2组在2 μL Cas12a时表现出最佳的荧光强度，而crRNA3组在1 μL Cas12a时表现最佳，所有组的信号均显著高于阴性对照（****，p < 0.0001）。
使用2 μL crRNA和1 μL Cas12a，在初步温度37°C下评估了CRISPR/Cas12a检测的最佳反应时间，如图4E、G所示。早在5分钟就观察到了强烈的荧光信号，随着反应时间的延长信号强度显著增强，在10分钟时达到平台期。尽管10分钟后的信号强度有所提高，但由于5分钟的信号相对较弱，最终选择10分钟作为最佳反应时间，以确保足够的信号强度、可靠的定量和实际检测中的良好重复性。
随后，在2 μL crRNA和1 μL Cas12a以及10分钟反应时间的条件下，如图4F、H所示，在不同温度下评估了荧光信号强度。结果显示，crRNA2组在37°C时表现出显著的更强荧光，而crRNA3组在25°C时达到最高的信号强度。两组在所有温度下的信号均显著高于阴性对照（****，p < 0.0001）。尽管crRNA3在25°C时显示出稍强的荧光，但最终选择37°C作为最佳反应温度，以确保与之前的RPA扩增步骤（在39°C下进行）更好的兼容性，并在接近室温的条件下保持更稳健和稳定的反应性能，这有利于潜在的现场检测应用。如图4所示，在整个优化过程中，crRNA3组的荧光强度始终高于crRNA2组。综合考虑检测成本、反应效率和信号稳定性，建立的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的最佳条件确定为：2 μL Cas12a反应缓冲液，1 μL HOLMES ssDNA Reporter（FAM），1 μL Cas12a蛋白（1 μM），2 μL crRNA（1 μM），1 μL RPA产物。反应温度：37°C。反应时间：10分钟。

3.4 RPA-CRISPR/Cas12a检测系统的特异性
使用了7种实验室保存的菌株作为模板，包括BS、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）。扩增使用gyrB特异性引物对F2/R1进行。如图3E所示，仅在BS中观察到目标的特异性扩增。这7种菌株进一步使用RPA-CRISPR/Cas12a检测系统进行分析。如图5A,D所示，只有BS显示出显著的荧光信号，而所有非BS菌株的信号仍处于背景水平。值得注意的是，即使与密切相关的蜡样芽孢杆菌也没有观察到交叉反应，表明crRNA2和crRNA3对BS具有高特异性。这些结果证实，建立的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法具有良好的物种特异性，可以准确识别BS，而不会受到系统发育相关的芽孢杆菌物种或常见食品borne病原体的干扰。

3.5 RPA-CRISPR/Cas12a检测系统的灵敏度
为了评估RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的分析灵敏度，首先确定了BS基因组DNA的检测限。BS的基因组DNA被连续10倍稀释，每个稀释度均用作RPA扩增的模板，随后进行CRISPR/Cas12a荧光检测。如图5B,E所示，crRNA2组达到了1.5 ng/μL的检测限，而crRNA3组的灵敏度显著更高，检测限低至150 pg/μL的基因组DNA。统计分析确认，在相同的DNA浓度下，crRNA3组的荧光强度明显高于crRNA2组（****，p < 0.0001）。CRISPR/Cas12a反应在10分钟内产生了可检测的荧光信号，表明建立的RPA-CRISPR/Cas12a方法结合了高检测灵敏度和快速响应时间。

为了测试纯细菌悬液的灵敏度，将BS培养物在对数生长阶段连续10倍稀释，浓度范围从5.5 × 10^6 CFU/mL到5.5 CFU/mL。使用煮沸方法从每个稀释度中提取基因组DNA，并进行RPA-CRISPR/Cas12a检测。如图5C所示，随着BS浓度的降低，荧光强度逐渐减弱。即使在水浓度低至5.5 CFU/mL的情况下，crRNA3组仍产生了清晰的阳性荧光信号，证实了其对活细菌的高灵敏度。

3.6 检测限（LOD）的定义及膨化酱油样品的检测
在图6A,C中，log10(CFU/mL)与Ct值之间的线性回归分析得到了标准曲线，方程为y = ?2.81x + 31.17（R2 = 0.9985），表明存在强正相关。根据定义的LOD阈值（MeanNEG + 3 × SDNEG = 2.45 × 10^3 RFU），基于crRNA2的检测方法的LOD确定为2.45 × 10^3 RFU（相当于55 CFU/mL）。

为了评估建立的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的实际适用性，使用crRNA3系统检测了天然膨化的酱油样品。如图6E所示，煮沸法和CTAB法（附录A）都产生了大约13 × 10^3 RFU的强烈荧光信号，这显著高于3σ规则确定的LOD阈值2.30 × 10^3 RFU。这些结果确认了膨化酱油样品中存在BS。两种提取方法之间没有显著差异，表明简单的煮沸法适用于现场检测。总之，开发的检测方法符合膨化酱油中BS检测的LOD要求，并提供了快速可靠的现场检测工具。

4. 讨论
在这项研究中，开发并优化了一种针对gyrB基因的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法，用于特异性检测BS[21]。我们的结果表明，gyrB基因是一个可靠的靶基因，能够清楚区分BS及其系统发育密切相关的蜡样芽孢杆菌以及其他常见的食品borne细菌[8]。这一结果与先前的研究一致，即gyrB基因在密切相关的芽孢杆菌物种中的序列变异性高于16S rRNA基因，因此支持其用于物种特异性检测的适用性[22]。

在反应优化过程中，crRNA的剂量显著影响Cas12a的切割活性，2 μL的crRNA被确定为产生足够荧光信号的最佳剂量。同样，Cas12a蛋白浓度也影响反应效率，1 μL提供了信号强度和检测成本之间的最佳平衡。尽管crRNA3在25°C时显示出稍高的荧光，但选择37°C作为最佳温度，以确保与之前的RPA反应更好的兼容性和更稳定的性能，适合现场应用。虽然早在5分钟时就可以检测到信号，但选择10分钟以确保信号稳定且可重复，而不是仅仅依赖于最小可检测时间点。建立的RPA-CRISPR/Cas12a系统在37°C下启动链切割，并在5分钟内产生可检测信号，整个检测过程（包括RPA扩增和CRISPR/Cas12a反应）可以在大约30分钟内完成[23]。这种效率比传统的PCR或qPCR方法快得多（后者通常需要60–90分钟）。快速的检测速度、等温反应条件和简单的操作减少了对该类大型精密仪器的依赖，使得该方法适用于现场快速检测[24,25]。

灵敏度评估显示，建立的检测方法在基因组DNA和纯细菌悬液样品中对BS显示出较低的检测限。作为一种广泛使用的益生菌，根据《益生菌健康食品应用和评估规定（试行）》及相关工业标准[26]，BS在保质期内需要保持至少1 × 10^6 CFU/g（mL）的活菌计数。本研究中获得的灵敏度完全满足益生菌产品的定量监测要求。对于食品安全监测，典型的食品borne芽孢杆菌病原体蜡样芽孢杆菌的监管限通常设定为10^5 CFU/g[27]。虽然没有为BS作为污染物指定全国统一的限值，但当前方法的灵敏度足以监测食品中的芽孢杆菌物种[28]。然而，必须强调的是，目前的研究是在实验室培养的纯菌株水平上进行的。尽管如此，该检测方法已成功应用于检测膨化酱油样品中的BS，证明了其在典型变质食品基质中的实际可行性。在实际样品中，基质干扰、背景微生物竞争和DNA提取效率仍可能影响实际的检测性能。因此，要在常规食品监测中更广泛地应用该方法，还需要进一步使用人工污染或实际食品样品进行评估。

5. 结论
在这项研究中，建立了一种针对gyrB基因的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法，用于快速可视化检测BS。优化的crRNA3具有富含PAM序列，使得Cas12a的切割活性高效。在37°C和10分钟的优化条件下，该方法对基因组DNA的检测限为150 pg/μL，对纯细菌悬液的检测限为5.5 CFU/mL。该方法对测试菌株表现出良好的特异性，与蜡样芽孢杆菌或其他常见食品borne细菌没有明显的交叉反应[8]。这些结果表明，RPA-CRISPR/Cas12a系统为纯菌株水平上BS的检测提供了一种有前景、灵敏且快速的方法。因此，在更广泛的应用之前，需要进一步验证，包括针对更广泛的系统发育相关芽孢杆菌物种的测试、在添加了目标菌的样品中的评估，以及与qPCR和基于培养的标准程序的比较。