《Foods》：Synthesis, Structural Characterization and In Vitro Immunosuppressive Activity of Quinoa Bran Soluble Dietary Fiber–Gallium Complex
Hongyang Shu,
Yichen Ai,
Huajie Yin,
Qiyuan Zhang,
Sangguan You,
Ruijuan Yang and
Yunfei Ge
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为解决食品中枯草芽孢杆菌污染导致的胀包和腐败问题，研究人员通过整合重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a技术，开发出一种针对gyrB基因的快速可视化检测方法。该方法在37℃下10分钟内可实现对基因组DNA 150 pg/μL和菌悬液5.5 CFU/mL的高灵敏度检测，且能特异性区分近缘种，为食品工业现场检测提供了高效工具。
在食品工业中，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis, BS）是一类具有“双面性”的微生物：它既是生产发酵食品和益生菌制品的有益菌，又可能因厌氧代谢产生气体，导致包装食品如酱油、臭豆腐等发生“胀包”现象，造成经济损失。传统的检测方法如培养法、免疫分析乃至PCR技术，往往耗时较长、操作繁琐或存在假阳性风险，难以满足现场快速检测的需求。因此，开发一种兼具高灵敏度、高特异性与操作便捷性的检测技术，对于食品质量监控与安全保障具有重要意义。
近日，一项发表于《Foods》的研究提出了一种创新性的解决方案——基于重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a系统（RPA-CRISPR/Cas12a）的快速可视化检测方法。该方法巧妙地融合了RPA的等温扩增效率与CRISPR/Cas12a的序列特异性识别及反式切割活性，成功实现了对枯草芽孢杆菌的精准、快速检测。
为完成这项研究，作者团队主要运用了以下几项关键技术：首先，针对枯草芽孢杆菌gyrB基因的保守区域设计特异性RPA引物和crRNA。其次，建立了RPA与CRISPR/Cas12a的两步反应体系，并系统优化了反应温度、时间及关键组分（如crRNA和Cas12a蛋白）的用量。最后，利用该体系对枯草芽孢杆菌的基因组DNA和纯菌悬液进行了灵敏度测试，并评估了其对包括近缘种蜡样芽孢杆菌在内的多种常见食源性致病菌的特异性。此外，研究还使用了自然胀包的酱油样品进行实际应用验证。
研究结果
3.1. RPA与crRNA引物的设计及筛选
研究选择gyrB基因作为检测靶点，因其在芽孢杆菌属内保守且种间差异足够大。通过琼脂糖凝胶电泳从六对RPA引物组合中筛选出最优的F2R1引物对。随后针对RPA扩增产物设计了三条crRNA，荧光检测显示，针对TT-rich PAM位点的crRNA3比针对TTT-rich PAM位点的crRNA2展现出更优的反式切割效率，而针对TTTT-rich PAM位点的crRNA1则无活性，因此后续研究主要围绕crRNA2和crRNA3展开。
3.2. RPA反应条件的优化
通过梯度温度与时间实验，确定RPA反应的最佳条件为39℃、15分钟。在此条件下，RPA扩增显示出高特异性，仅对枯草芽孢杆菌DNA产生扩增条带，对蜡样芽孢杆菌等其他测试菌株无交叉反应。灵敏度测试表明，其对基因组DNA的最低检测限可达10-5ng/μL。
3.3. RPA-CRISPR/Cas12a检测体系的优化
对CRISPR/Cas12a检测模块的组分和条件进行优化。确定最佳反应体系为：2 μL Cas12a反应缓冲液、1 μL HOLMES ssDNA Reporter (FAM)、1 μL Cas12a蛋白、2 μL crRNA、1 μL RPA产物。最佳反应条件为37℃、10分钟。尽管crRNA3在25℃时信号略强，但选择37℃可更好地与RPA步骤衔接，并更利于现场应用。
3.4. RPA-CRISPR/Cas12a检测系统的特异性
使用包括枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌等七种菌株的基因组DNA进行测试。结果显示，仅枯草芽孢杆菌样品产生了强烈的荧光信号，而其他所有菌株（包括近缘的蜡样芽孢杆菌）的信号均与阴性对照相当，证明了该方法具有优异的物种特异性。
3.5. RPA-CRISPR/Cas12a检测系统的灵敏度
对枯草芽孢杆菌基因组DNA进行10倍梯度稀释检测。crRNA2组的检测限为1.5 ng/μL，而crRNA3组的灵敏度更高，检测限达到150 pg/μL。在纯菌悬液检测中，crRNA3组在菌浓度低至5.5 CFU/mL时仍能产生清晰的阳性荧光信号，显示出极高的检测灵敏度。
3.6. 检测限的定义及对胀包酱油样品的检测
通过3σ规则定义检测限，并建立荧光强度与菌浓度的标准曲线。crRNA3体系的检测限对应5.5 CFU/mL。将该体系应用于自然胀包的酱油样品检测，分别采用煮沸法和CTAB法提取DNA，均产生了远高于检测限阈值的强荧光信号（约13 × 103RFU），成功检出样品中的枯草芽孢杆菌，且两种DNA提取方法结果无显著差异，表明简单的煮沸法已适用于现场快速检测。
结论与讨论
本研究成功建立并优化了一种针对枯草芽孢杆菌gyrB基因的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法。优化的crRNA3（具有TT-rich PAM位点）能有效引导Cas12a的反式切割活性。在37℃、10分钟的最佳条件下，该方法对基因组DNA和纯菌悬液的检测限分别达到150 pg/μL和5.5 CFU/mL，且对测试的其他食源性病原菌（包括近缘的蜡样芽孢杆菌）无交叉反应，显示出高特异性与高灵敏度。
该方法的建立具有多重意义：其一，它将RPA的快速等温扩增优势与CRISPR/Cas12a的高特异性识别能力相结合，整个检测过程可在约30分钟内完成，远快于传统的PCR方法。其二，反应在恒温下进行，对仪器依赖小，配合可视化荧光读数，非常适合食品生产一线的现场快速筛查。其三，研究首次将此法应用于实际胀包酱油样品的检测并取得成功，验证了其在实际复杂食品基质中的可行性。
当然，本研究目前主要在纯菌层面进行，在实际食品样本中，基质干扰、背景微生物竞争等因素可能影响检测性能。未来的研究需要在更多种类的实际食品样本中进行验证，并进一步评估基质效应，以推动该方法在常规食品监测中的广泛应用。总之，这项研究为食品中枯草芽孢杆菌的快速、准确检测提供了一种强有力的新工具，在保障食品安全和质量控制方面具有广阔的应用前景。
