微流控技术对大麻二酚纳米乳液理化性质的影响 安德烈斯·费尔南多·桑切斯·马丁内斯（Andrés Fernando Sánchez Martínez） 路易斯·爱德华多·迪亚斯·巴雷拉（Luis Eduardo Diaz Barrera） 娜塔莉亚·伊丽莎白·康德·马丁内斯（Natalia Elizabeth Conde Martínez） 罗莎·海伦娜·布斯塔斯·克鲁兹（Rosa Helena Bustos Cruz） 玛莎·希梅娜·莱昂·德尔加多（Martha Ximena León Delgado） 玛丽亚·希梅娜·金塔尼利亚·卡瓦哈尔（María Ximena Quintanilla Carvajal）

《Nanomaterials》：Effect of Microfluidization Technique on the Physicochemical Characteristics of Cannabidiol Nanoemulsions Andrés Fernando Sánchez Martínez, Luis Eduardo Diaz Barrera, Natalia Elizabeth Conde Martínez, Rosa Helena Bustos Cruz, Martha Ximena León Delgado and María Ximena Quintanilla Carvajal

　　摘要：本研究探讨了微流化技术对用于局部应用的大麻二酚（CBD）纳米乳液物理化学性质、稳定性、释放行为和细胞相容性的影响。CBD是一种非精神活性的大麻素，具有抗炎和镇痛作用；然而，由于其溶解度低和生物利用度差，其治疗效果受到限制。为了解决这些问题，研究人员使用鳄梨油和Tween 80制备了纳米乳液，并通过Box–Behnken实验设计优化了工艺参数，包括微流化压力（5000–20,000 PSI）、CBD浓度（0–2%）和油含量（8–10%）。在60天的时间内，对纳米乳液进行了滴粒大小、分散度指数（D）和Zeta电位等指标的表征。实验结果表明，提高处理压力可以减小滴粒大小和分散度，最佳压力范围为11,000至15,000 PSI。较高的油和CBD浓度会增加了Zeta电位的幅度，有助于系统的电静力稳定。纳米乳液的包封效率达到了约81.4%。在HaCaT角质形成细胞中的细胞活力检测未见显著毒性作用。优化后的配方表现出S型CBD释放曲线，该曲线可很好地用Weibull和Gompertz模型描述（R2 ≈ 0.99），表明释放过程同时涉及扩散和界面作用机制，从而实现了高效的局部递送。

1. 引言
肌肉骨骼系统疾病影响所有年龄段的人群，2019年全球约有17.1亿人患有此类疾病。肌肉骨骼疾病的诊断和类型取决于年龄和环境因素，但这类疾病广泛存在于不同年龄段的群体中[1]。肌肉骨骼不适最明显的外在症状之一是炎症反应，这是身体免疫系统识别并清除有害或外来刺激的过程，从而启动愈合机制[2]。目前市场上有多种用于肌肉恢复和局部缓解的产品，其中非甾体抗炎药（NSAIDs）是最常用的治疗手段。然而，约5.7%的患者使用这些药物后会出现过敏反应，这些反应通常由免疫介导，持续时间从几天到几年不等。作为替代方案，人们开发了基于天然化合物的制剂，这些制剂采用多种提取方法制备[3]。但这些替代疗法通常作为非处方药（OTC）或通过网络平台销售，其生产过程和质量控制的不确定性可能导致杂质或污染物的存在，可能产生不良影响。桉叶油因其局部适用性和抗菌活性而被广泛用作NSAIDs的替代品[4]，但内服时可能带来健康风险[5]。大麻植物含有多种具有开发功能性产品潜力的成分，尤其是大麻二酚（CBD）和Δ9-四氢大麻酚（Δ9-THC）。尽管这两种成分在分子结构上相似，但它们对内源性大麻素受体的作用机制存在显著差异[7]：Δ9-THC是CB1和CB2受体的部分激动剂，具有精神活性和抗炎作用；而CBD则通过非直接结合调节受体活性，影响血清素和腺苷受体，并抑制脂肪酸酰胺水解酶1（FAAH），从而增加花生四烯酸氨基乙醇酸（anandamide）的水平[8]。这使得CBD具有抗炎和神经保护作用而不引起心理效应[9]。目前有多种含有CBD的产品用于缓解疼痛，无论是局部使用还是口服[10]，但口服后CBD会在体内经历药代变化，增加Δ9-THC的生成[11]。口服CBD产品有10%的概率引发不良反应[12]，可能包括嗜睡、腹泻、食欲减退、疲劳、呕吐、发热、乏力、癫痫发作、上呼吸道感染和肝功能异常[13]。此外，这些产品可能干扰与其他药物的药理相互作用，导致严重不良反应和治疗失败[12]。因此建议使用局部制剂，但并非所有活性成分都能穿透皮肤。有效的皮肤渗透取决于分子大小和物理化学性质，通常微米级的分子比大分子更易穿透皮肤[14]。因此，设计、表征和控制含有CBD纳米乳液的局部制剂的颗粒大小至关重要[15]。颗粒大小的选择需根据应用类型和目标组织来确定，较小的颗粒更易穿透皮肤层[16]。有效的皮肤穿透所需的最佳颗粒直径应在纳米范围内[17]。为了通过局部途径而非口服途径将CBD分子引入体内，需要进行包封[18]。有多种方法可用于CBD等活性成分的纳米包封，如溶剂蒸发、喷雾干燥和微流化[19]。虽然超声波处理能有效减小颗粒大小，但难以大规模应用；相比之下，微流化不仅减小颗粒大小，还能降低成本，适用于工业生产[20]。微流化是一种高能耗工艺，在高压空气作用下将油相和水相混合，形成高效的纳米级递送系统[21]。该方法在纳米递送系统的开发中具有优势，尤其适用于制备颗粒大小约为160 nm的稳定纳米乳液[22]。因此，本研究旨在探讨微流化技术对CBD纳米乳液物理化学性质的影响及其对HaCaT细胞的作用。

2. 材料与方法
2.1 材料
CBD晶体由CLEVER LEAVES（美国佛罗里达州）和Tocancipá（哥伦比亚昆迪纳马卡省）提供。CBD晶体从美国总部运抵Tocancipá后，储存在La Sabana大学设施中，符合2022年司法部、农业农村发展部及卫生社会保障部制定的指南要求[22]。选择Tween 80作为表面活性剂，因其具有乳化能力和食品级安全性，由SUQUIN S.A.S.（哥伦比亚桑坦德省布卡拉曼加）供应。鳄梨油来自GRUPO NUTRESA S.A.（哥伦比亚麦德林）。根据技术数据表，该橄榄油的主要脂肪酸组成包括棕榈酸（28.21%）、棕榈油酸（5.69%）、硬脂酸（0.70%）、油酸（50.95%）、亚油酸（13.87%）和亚麻酸（0.58%）。体外实验使用HaCaT细胞，这些细胞在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养[23]。细胞毒性评估使用MTT试剂（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物，Sigma-Aldrich）进行；formazan晶体的溶解使用二甲基亚砜（DMSO）[23]。色谱分析采用HPLC级甲醇（Sharlau，西班牙巴塞罗那）和HPLC级水（Sharlau，西班牙巴塞罗那）作为移动相溶剂[23]。

2.2 实验设计
采用Box–Behnken实验设计评估三个因素对纳米乳液配方的影响：微流化压力（5000–20,000 PSI，A）、CBD浓度（0–2% w/w，B）和鳄梨油浓度（8–10% w/w，C）。本研究测量的响应变量包括滴粒大小（nm）、Zeta电位（ζ）和分散度（D）。目标是确定确保纳米乳液稳定性和物理化学特性的最佳配方和处理压力。实验条件持续60天，期间定期测量分散度、滴粒大小和Zeta电位[23]。

2.3 纳米乳液的制备
纳米乳液的制备首先通过预乳化阶段形成粗粒乳液。水相按先前优化配方（补充材料）将Tween 80溶解在蒸馏水中，浓度为3% w/w。该相在65 °C下通过加热板加热处理，以降低界面张力和粘度。同时，使用Ultra-Turrax T-18分散器（IKA，哥伦比亚波哥大）在11,000 rpm下进行高剪切均质化，破坏初始颗粒结构。同时，在控制温度（约70 °C）下将CBD晶体溶解在鳄梨油中，确保完全溶解和分子均匀分布。油相浓度范围为8%至10% w/w，CBD含量为0%至2% w/w。当脂质相均匀后，将其以恒定流速逐滴加入到水相中，促进表面活性剂的界面吸附并减少过早聚集。随后，在65 °C下继续高剪切均质化10分钟，以减小滴粒大小并提高分散均匀性。此步骤确保了高压处理前的颗粒稳定。在此阶段采集一部分样品作为微流化前的基线，以便后续评估处理后的颗粒分布和物理化学性质[23]。

2.4 微流化参数优化
通过实验确定微流化次数对乳液稳定性的影响。初步实验表明，过度处理会导致乳液不稳定。最终选择循环次数为2次，此时乳液稳定性良好且无需过多能源消耗。微流化压力范围设定为5000–20,000 PSI。处理后，使用LM10微流化仪（Microfluidics，英国剑桥）对乳液进行处理，每次取约20 mL样品。一个样品冷藏，另一个样品室温保存以进行稳定性分析[24]。

2.5 稳定性研究
通过监测四个关键参数评估纳米乳液的稳定性：Zeta电位（mV）、滴粒大小（nm）和分散度（D），并在五个时间点（0、8、15、30和60天）进行表征。样品在8 °C和20 °C两种温度条件下储存，以评估温度对系统稳定性的影响。测量前将样品用去离子水按1:1000稀释，然后使用Zetasizer NanoZS（Malvern Instruments，英国剑桥）进行测量[24]。Zetasizer配备激光衍射仪，测量在25 °C下进行，每个实验重复三次以确保结果的可重复性和可靠性[24]。为进一步观察相分离和其他物理变化，样品被转移到Falcon管中观察[25]。

2.6 包封效率测定
包封效率（EE）采用[26,27]的方法进行测定，并对此方法进行了改进，以增强相分离和分析的稳健性。具体操作是将15 mL纳米乳液样品在4 °C下以10,000 rpm离心30分钟，诱导不稳定和部分破乳。此过程形成半透明的上清液脂质相，使用负压移液器小心收集以避免界面破坏和交叉污染[27]。回收的含CBD的油相在色谱移动相中稀释，确保完全溶解并兼容分析系统[15]。定量分析采用高效液相色谱（HPLC），色谱柱为SOLAS 100 ? C18反相柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）[28]。移动相由甲醇和水（45:55，v/v）组成，流动速率为0.7 mL/min[29]。柱温维持在40 °C，检测波长为214 nm[29]。两种标准品和样品的注射体积均为5 μL，总运行时间为23分钟，以确保足够的分辨率和系统的适用性[30]。通过将1毫克纯CBD溶解在甲醇中并调整至恒定最终体积，制备了CBD标准储备溶液（1 mg/mL）。从这个储备溶液中制备了一系列稀释液，以构建外部校准曲线，生成最终浓度分别为0.008、0.010、0.015、0.020、0.030和0.040 mg/mL的标准溶液[31]。定量分析是通过峰值面积与浓度的线性回归来进行的。包封效率根据以下公式计算：%Efficiency = Mquantified/Minitial × 100 (1) 其中Mquantified是油相中检测到的CBD量，Minitial是在配方过程中添加的CBD总量。

2.6. 最优纳米乳液的热行为
使用差示扫描量热法（DSC）评估了优化后的CBD纳米乳液的热行为。分析采用了Mettler Toledo DSC（美国OH公司）设备。大约10毫克的样品被放置在DSC样品池中，在氮气氛围下以10°C/分钟的加热速率将温度从20°C逐渐升高到180°C。得到的热图提供了关于乳液热稳定性和相变的信息[32]。

2.7. 释放动力学
采用了一个带有11微米膜的Franz细胞。纳米乳液被沉积在膜的上部，通过重力作用保持持续接触[33]。此外，整个过程在大约37°C的等温条件下进行。接收介质是由丙二醇和乙醇按7:3的比例混合而成的液体，并保持恒定温度和360 RPM的搅拌速度。每隔15分钟取样一次，并在209纳米处使用UV-可见光分光光度计进行测量。

2.8. 细胞活力
使用来自德国曼海姆Cytion公司的HaCaT细胞系评估CBD纳米乳液的细胞毒性和细胞活力。细胞以每个孔3 × 10^4个细胞的密度接种到96孔板中。24小时后，更换培养基，并向孔中加入最终浓度为10%的最佳CBD纳米乳液和对照系统。暴露24小时后，移除培养基，向每个孔中加入50 μL MTT溶液。细胞在37°C和5% CO2的条件下再孵育24小时。然后弃去上清液，将formazan晶体溶解在100 μL的10%二甲基亚砜（DMSO）中。使用微孔板读取器在595纳米处测量吸光度[34]。

2.9. 统计数据分析
使用Design Expert软件版本10.0.7（Stat-Ease Inc., MN, USA）进行统计分析。进行了方差分析（ANOVA），以评估CBD浓度、鳄梨油浓度和微流化压力对纳米乳液稳定性和物理化学性质的影响。因素的显著性在95%的置信水平下进行评估。结果使用二次和线性模型进行分析，并采用响应面方法优化实验条件。

3. 结果与讨论
3.1. 稳定性研究
评估了经过1次和2次微流化处理的纳米乳液，以分析循环次数对产品稳定性的影响，而不考虑实验设计中考虑的其他因素。稳定性研究在两种储存条件下进行：室温（20°C）和冷藏（4°C），以确定储存温度是否显著影响纳米乳液的稳定性[35]。这种类型的产品可能会发生各种不稳定现象，需要评估起霜（产品表面形成可见层）或完全相分离的可能性[36]。分别在0天、8天、15天、30天和60天取样，监测液滴大小、分散度（D）和ζ电位的变化。表A1展示了在20°C下经过1次和2次微流化处理的每种纳米乳液的相关结果。
如表A1所示，纳米乳液4、10和17在ζ电位方面表现出明显的稳定性。然而，需要注意的是，微流化后系统处于高能量状态，可能导致ζ电位值超出典型的胶体稳定范围（±30 mV）。
在分散度方面，明显的是，在较低压力下处理的乳液显示出显著更高的分散度值。这表明所施加的能量不足以有效破坏液滴，导致更广泛的大小分布[37]。压力在确保液滴大小分布均匀性方面起着关键作用，因为较低的压力导致能量传递较少，从而液滴破碎效果较差，分布较宽[38]。较高的压力由于增强了液滴破碎效果，导致液滴尺寸变小[39]。表A1还显示，一些纳米乳液在微流化器中循环处理后液滴尺寸进一步减小。这表明两次微流化处理可以更有效地破坏液滴，从而减小其尺寸。众所周知，循环处理可以增强乳化效果，并显著减少液滴尺寸[40]。
分散度值也受到微流化次数的显著影响。在许多情况下，第二次循环后分散度降低。循环处理导致额外的液滴破碎，产生更窄的液滴尺寸分布，因此分散度值更接近0.2——这一阈值通常与良好的胶体稳定性和较低的相分离风险相关[41]。尽管表A1中的分散度值总体较低，但经过两次循环处理的纳米乳液往往显示出更低的分散度值，表明更加均匀。这一效应在纳米乳液7中尤为明显，其分散度为0.123。这些结果支持增加循环次数可以提高系统均匀性并减少液滴尺寸变异性的观点[42]。
ζ电位值始终为负值，这是由于形成纳米乳液的液滴具有界面电荷[43]。在较低的压力下，液滴破碎程度较低可能导致表面电荷积累增加，从而增加静电排斥力，提高系统稳定性[44]。如表A1所示，ζ电位值证实了这种负表面电荷，并表明液滴之间存在排斥作用[45]。有趣的是，仅经过一次循环处理的乳液显示出比经过两次循环处理的乳液更负的ζ电位。这可能是因为第二次循环过程中液滴更加均匀，减少了表面电荷的差异，从而降低了ζ电位的绝对值[46]。
图2清楚地表明，在微流化器中的循环处理影响了大多数情况下的液滴尺寸分布。在某些情况下，第二次循环后观察到液滴尺寸增加，这可能是由于系统中固体含量较高所致。此外，对于许多配方来说，循环次数之间粒径相对保持稳定，表明第一次微流化循环已经能够产生足够小的液滴[47]。然而，在某些乳液中，第二次循环后观察到改善，表明额外的循环处理可以进一步提高均匀性并进一步减小粒径[48]。

图2. 在20°C下评估的配方在第一次循环和第二次循环中的液滴尺寸分布的图形分析。误差条代表标准偏差。在某些配方中，第二次循环后液滴尺寸增加。这可能是由于重新聚集现象，即额外的机械能量促使较小的液滴融合成较大的液滴[49]。这也可能与Tween 80的浓度不足有关，Tween 80是一种负责在水相中稳定油滴的非离子表面活性剂。选择Tween 80是因为它能够降低界面张力并防止聚集。然而，如果其浓度不足，特别是在第二次循环后，新生成的液滴可能无法充分被覆盖，增加了融合的可能性[50]。
图3中的ζ电位行为支持这一观察结果。对于大多数配方来说，高压下的额外循环改变了ζ电位值，表明可能存在不稳定性[51]。这可能是由于液滴破碎增强，当颗粒相互靠近时，吸引力超过了排斥力，导致聚集和乳液不稳定[52]。图3. 在20°C下评估的配方在第一次循环和第二次循环中的ζ电位分布的图形分析。误差条代表标准偏差。然而，在某些配方中，第二次循环后ζ电位值保持相似或变得不那么负。这可能与表面活性剂的浓度和整个系统组成有关。Tween 80在稳定纳米乳液方面起着关键作用，其在额外处理过程中覆盖液滴表面积的能力可能有限[53]。第二次循环后ζ电位的变异性可能表明表面活性剂不再能够稳定所有新形成的液滴，导致ζ电位值不那么负，静电稳定性降低[54]。在某些情况下，两次循环之间ζ电位的微小变化表明系统在第一次循环后已经达到表面电荷平衡，进一步处理没有显著改变静电相互作用[55]。
为了进一步探讨温度的作用，样品也在4°C下储存，并在相同的间隔时间进行分析，同时确保测量之间的干扰最小。在0天时，样品进行了四小时的调节，因为它们的微流化后温度接近45°C。表A2显示了在这些冷藏条件下纳米乳液的行为，表明增加压力在两种温度条件下都导致了更小的粒径，大多数结果在150到190纳米之间[56]。然而，在4°C下储存并在5000 psi下处理的乳液通常显示出较大的液滴尺寸，这表明低温可能影响尺寸减小效率或稳定机制[57]。
在ζ电位方面，冷藏样品通常显示出更负的值，在某些实验中达到-36 mV，这可能表明在低温储存下静电排斥力增强[58]。这种行为可能与低温下热运动减少有关[59]。然而，这一趋势并非在所有条件下都一致，因为在一些在较低压力下处理的样品中，ζ电位值不那么负，表明有更高的聚集倾向。
分散度趋势在两种温度条件下总体一致，较高处理压力下分散度值较低，反映了更窄的液滴分布[60]。尽管如此，冷藏乳液的分散度值通常比室温下的乳液更高，尤其是在较低压力下。重要的是，尽管有一些迹象表明静电稳定性有所改善，但在冷藏样品中仍然观察到明显的起霜现象，特别是在较低压力下。这表明冷藏可能对系统的整体物理稳定性产生负面影响，强调了仅靠ζ电位不足以完全描述这些乳液的稳定性[61]。

3.2. 配方优化和操作条件改进
使用Design Expert V10.0.7软件，输入了从第0天到第60天在预定义储存和处理条件下收集的实验数据用于建模。对每个响应变量（液滴尺寸分布、ζ电位和分散度（D）进行了ANOVA分析，以确定平均差异的显著性并识别最具影响力的输入因素[62]。
表A3显示了ANOVA模型的p值，用绿色编码以指示特定实验运行的统计显著性。基于这一分析，选择了进一步的响应面建模和输入变量优化所需的实验条件。
分析表明，60天后没有检测到响应变量之间的统计显著差异，表明系统已达到热力学平衡[63]。相比之下，在第30天发现了显著差异，使这个时间点成为评估响应变量随输入参数变化的理想时机[64]。
在所有变量中，微流化压力对液滴尺寸和分散度的影响最大。较高的压力产生了更大的剪切力，减小了液滴尺寸并增加了界面面积，从而提高了系统稳定性和均匀性[65]。分散度值< 0.1表示适合制药应用的单分散系统[66]。分散度在0.1到0.2之间表明中等均匀性，而超过0.2的值表示较高的变异性[67]。当前配方的分散度范围为0.128到0.403。
ζ电位分析（表A3）表明，压力和鳄梨油浓度显著影响了表面电荷。压力增加使得潜在效应更加负面，这表明了更强的静电排斥作用，从而提高了胶体的稳定性[68]。油浓度的变化通过改变Tween 80的方向和表面电荷来影响液滴界面特性[69]。油浓度的低p值（p = 0.0176）表明过量的油可能会降低表面电荷密度并破坏乳液的稳定性[70]。另一方面，CBD浓度对zeta电位的影响很小，可能是因为CBD主要存在于油相中而不是界面处[71]。基于这些发现，选定了以下参数进行深入建模：

稳定性评估日：第30天
储存温度：20°C
微流控循环次数：1次循环
由于缺乏显著变化，第60天被排除在ANOVA建模之外，但保留用于长期稳定性分析。由于观察到乳液分层现象和额外的能量消耗，冷藏储存也被排除[72]。选择1次循环的原因是模型拟合度足够高（R2 = 0.75）且能量需求较低[73]。

图4显示了液滴尺寸的响应面。随着压力的降低，尤其是在较低的CBD浓度下，液滴尺寸增大。这与高压会产生更细小乳液的原则相符[74]。CBD浓度表现出非线性响应。初始时CBD浓度的增加会减小液滴尺寸，但超过某个阈值后，粘度效应限制了尺寸的进一步减小[75]。图5显示，在低压下较高的油浓度会导致更大的液滴，增加了不稳定性风险[76]。最佳压力范围确定为11,000至15,000 PSI之间，这平衡了能量消耗和液滴尺寸的减小。超过15,000 PSI后，尺寸的微小改善并不足以证明增加能量的合理性[77]。

图4. 液滴尺寸分布的响应面，其中(a)代表三维表面，(b)代表以油浓度为固定因子的二维表面。图中的红点表示Box-Behnken方法的中点和极端值。

图5. 液滴尺寸分布的响应面，其中(a)代表三维表面，(b)代表油浓度为10% w/w时的二维表面。图中的红点表示Box-Behnken方法的中点和极端值。zeta电位大于30 mV表明有良好的静电稳定性[78]。图6证实，较高的压力产生更负的zeta电位（约-35 mV），由于表面电荷暴露更多而增强了稳定性[79]。zeta电位也与CBD浓度相关：较高的浓度增加了排斥力的大小[76]。图6显示，过量的油浓度会降低表面电荷，从而降低zeta电位[80]。图7和图8显示，在低油浓度和1–2% CBD的情况下，最佳zeta电位出现在11,000至14,000 PSI之间。尽管zeta电位较高，但液滴尺寸仍然太大，不利于长期稳定性[81]。

图6. zeta电位的响应面，其中(a)代表三维表面，(b)代表以油浓度为固定因子的二维表面。图中的红点表示Box-Behnken方法的中点和极端值。

图7. zeta电位的响应面，其中(a)代表三维表面，(b)代表油浓度为10% w/w时的二维表面。图中的红点表示Box-Behnken方法的中点和极端值。图8. zeta电位的响应面，其中(a)代表三维表面，(b)代表油浓度为8% w/w时的二维表面。图中的红点表示Box-Behnken方法的中点和极端值。设计专家的数值优化得出的优度值为0.821，表明整体优化程度很高。最佳配方如下：
压力：12,538 PSI；
鳄梨油：9.39% w/w；
Tween 80：3% w/w；
CBD：2% w/w；
水：余量至100%。
这种配方支持高稳定性和功能性[15]。

表1总结了三个响应变量的拟合模型系数，包括p值、自由度以及模型性能指标（R2、调整后的R2）。根据这一分析，最佳纳米乳液配方被定义为能够达到最佳物理化学性质组合的一组加工条件，特别是最小化液滴尺寸、低分散度和适当的zeta电位，确保了胶体的稳定性[15]。

表1. 分析响应面模型的方差（ANOVA），评估工艺变量对液滴尺寸（D）、分散度（D）和zeta电位的影响。

3.3. 包封效率的确定
使用从0.008至0.040 mg/mL的标准溶液构建的外部校准曲线来量化纳米乳液中的大麻二酚（CBD）含量[82]。校准曲线显示出优异的线性，确定系数（R2）为0.9922，从而验证了量化方法的可靠性[83]。根据这一分析，CBD纳米乳液的封装效率（EE）被确定为81.4% ± 1.5%，表明CBD在纳米乳液系统的油相中的捕获非常有效[84]。这一高效率突显了CBD对脂质环境的强亲和力，与其亲脂性质和水介质中的溶解度较低相符[75]。结果表明，大部分活性化合物保留在分散的油滴中，而不是分配到水相中[85]。

考虑到CBD的物理化学特性，这种效率尤为重要。作为一种疏水分子，CBD在中链甘油三酯和其他非极性或轻微极性溶剂中具有较高的溶解度，这有助于其在油包水纳米乳液的内部相中保持稳定[86]。这一现象得到了其他研究的支持[87]，这些研究表明，当适当乳化时，大麻素几乎完全分配到油相中[88]。

观察到的封装效率处于通常报道的大麻素纳米乳液效率范围内，一般在70%到90%之间，具体取决于配方和工艺变量[89]。正如[89]所指出的，这个范围内的效率表明配方是稳健的，表面活性剂、油相和加工条件的选择是合理的[90]。在这种情况下，液滴尺寸和分散度（D）与优化配方报告的结果非常接近，进一步证明了纳米乳液矩阵的稳定性和均匀性，这两个参数对于高效封装至关重要[91]。

影响封装效率的关键因素是液滴尺寸分布，它直接影响内部油相的表面积与体积比[92]。较小且更均匀的液滴（分散度低）通常提供更好的物理稳定性，并减少CBD从油相中的扩散。均匀性还确保了CBD在整个系统中的均匀分布，最小化了可能导致化合物迁移的浓度梯度[93]。相对较低的标准偏差（±1.5%）进一步证实了封装过程的可重复性和可靠性，表明纳米乳液系统的稳定性[94]。此外，高封装效率表明在加工过程中CBD的降解或损失较少，这对于热敏感或氧化敏感的化合物来说是一个重要考虑因素[95]。

这一结果对控释和生物利用度也有重要意义。较高的封装效率意味着更多的活性化合物保留在递送系统中，使得释放过程能够持续进行[96]。此外，封装在纳米级油滴中可以保护CBD免受光、氧气或酶活性等环境因素的降解——这是制药或营养保健品应用的基本要求[97]。此外，封装效果的优异表现还表明油相和表面活性剂系统之间的有效相互作用[98]。Tween 80由于其适当的亲水-疏水平衡（HLB），可能形成了一个稳定的界面层，既最小化了液滴团聚，又提供了对CBD扩散的有效屏障。这种界面稳定在保护封装化合物和维持配方物理稳定性方面起着关键作用[99]。

数据还表明，尽管未在此讨论，微流控参数也得到了适当优化，以产生小而稳定的液滴，从而提高了封装效率[100]。过大的液滴或不稳定的乳液容易释放封装的化合物，导致效率降低。因此，达到这一封装水平表明工艺条件成功保持了液滴的完整性[101]。

3.4. 最佳纳米乳液的热行为
进行了差示扫描量热法（DSC）分析，比较了优化后的纳米乳液、不含CBD的对照纳米乳液以及本例中的壁材（鳄梨油）。如图A1所示，壁材对温度变化的敏感性较低，这与基于其化学成分预期的鳄梨油热行为一致。相比之下，纳米乳液显示出与其复杂化学成分相关的特征性热峰。两种纳米乳液的热图都显示出热流量的轻微下降，这可能归因于Tween 80或水相的存在。这种行为可能表明了热松弛现象或系统中结合水的释放。

在大约60°C时，观察到一个吸热转变。这个峰可能对应于鳄梨油中脂质成分的熔化或CBD参与的特定相互作用，这些影响了系统的热行为。优化后的纳米乳液与对照组相比没有显示出这一吸热峰，表明这一转变与CBD的存在有关。

在70至90°C的温度范围内，观察到一个连续的吸热转变，这可能代表了前述事件的延续或纳米乳液系统中不同相的熔化。两种纳米乳液在大约94°C时都显示出最小峰，对应于一个放热事件。这种行为可能归因于纳米乳液内部的分子级重组过程，可能涉及脂质成分从无定形转变为更有结晶性的排列。

随后，在大约100°C时观察到一个吸热峰，这可能与配方中残留成分（如水或溶剂）的蒸发有关。然而，含CBD的纳米乳液中峰强度和形状的轻微差异表明CBD可能通过与脂质相的特定相互作用影响这些热转变。

3.5. 释放动力学
优化后的纳米乳液中大麻二酚（CBD）的释放曲线呈现出S形行为，这通常与多阶段释放系统相关[102]。如图9所示，释放过程包括一个初始快速释放阶段，随后逐渐减速，直到达到平台期，最终浓度接近初始CBD含量的2%，表明可释放部分已耗尽[103]。实验数据与多个动力学模型进行了拟合，以更好地描述系统行为。其中，Weibull模型和Gompertz模型的拟合度最高（R2 = 0.990），强调了它们适用于表示S形释放曲线的能力[104]。这些模型能够有效捕捉到释放速率随时间变化的系统，因为浓度梯度和系统结构发生了变化[105]。

与Weibull模型的良好吻合表明释放行为不能用单一机制来描述，而Gompertz模型能够很好地表示实验观察到的非对称S形趋势[106,107]。相比之下，传统的模型如Higuchi（R2 = 0.841）和Korsmeyer–Peppas（R2 = 0.851）的预测能力较低，表明基于扩散的简化方法不足以描述纳米乳液系统的释放行为[108]。与聚合物或凝胶基系统相比，观察到的相对较快的释放速度可能归因于纳米乳液的固有特性，包括较小的液滴尺寸、较大的界面面积和较低的粘度，这些都有利于质量传递[107,109]。

3.6. 细胞活力
使用HaCaT角朊细胞系进行了细胞毒性测试，该细胞系是评估皮肤相关配方的常用模型[85]。主要目的是确定优化后的纳米乳液在24小时暴露后是否会对HaCaT细胞层产生任何细胞毒性效应[91]。此外，还包括了一系列对照和替代处理，以区分配方中各个组分（如CBD、油、表面活性剂和溶剂）对细胞行为和活力的影响[91]。

如图10所示，在标准化条件下（37°C，n = 12）评估了八个处理组对HaCaT细胞活力的影响。结果显示，含有乙醇和2% CBD的处理方法显示出最高的表观活力，约为159% ± 29%，超过了对照组[105]。虽然这一结果可能表明细胞活性有所增加，但高于100%的数值应谨慎解读，因为MTT测定并不直接量化细胞增殖，而是反映了线粒体的代谢活性[88]。在某些实验条件下，该测定可能会由于四唑盐的酶促还原增加而高估活力，但这并不一定与细胞数量的增加相关[89]。因此，观察到的活力增加更适当地归因于代谢活性的增强，而不是细胞增殖增加的确切证据[106]。图10. 在37°C下培养24小时后，HaCaT细胞的细胞活力（n = 12）。数据以百分比活力表示。框中的X是算术平均值。溶解在乙醇中的游离CBD可能具有更高的溶解度和生物利用度，从而能够通过脂质双层快速被细胞吸收[110]。乙醇作为一种极性有机溶剂，有助于像CBD这样的疏水分子穿过细胞膜[111]。一旦被内化，CBD可能参与多种与抗氧化反应、线粒体活性和能量代谢相关的细胞内信号通路，从而起到生物能增强剂的作用[112]。这些通路包括内源性大麻素受体（CB1和CB2）的调节、MAPK/ERK信号传导以及与PPARγ的潜在相互作用，这些都已被报道与细胞增殖和存活有关[113]。此外，乙醇本身可能作为一种渗透增强剂，破坏膜脂质排列，促进溶质的运输[114]。在CBD存在的情况下，这种效应被放大，导致细胞内CBD浓度升高，这可能解释了观察到的异常高的活力百分比——远超过100%[115]。相比之下，含有10% DMSO的处理方法显示出最低的细胞活力，约为18% ± 6%，突显了其细胞毒性[116]。DMSO虽然在低浓度（<0.5%）下常用作溶剂和冷冻保护剂，但在高浓度下具有毒性[117]。它可以破坏细胞膜、使蛋白质变性、干扰钙的稳态并损害线粒体功能，最终引发凋亡或坏死途径[118]。这一组中观察到的活力急剧下降验证了DMSO作为阳性细胞毒性对照物的作用，证明了HaCaT模型在检测毒性方面的敏感性和可靠性[119]。含有1% CBD和2% CBD的最佳纳米乳液处理方法显示出显著但适度的细胞活力增加，分别为117% ± 17%和135% ± 25%。这些结果证实，纳米乳液配方不会引起细胞毒性效应，反而支持细胞存活和适度增殖[120]。重要的是，这些结果表明，尽管CBD的包封减缓了其释放速度，但仍有部分CBD分子可以接触细胞，这可能是由于包封不完全或CBD在表面吸附[121]。这种可控的释放机制模拟了缓释效果，这对于需要长时间作用和减少全身暴露的治疗应用可能是有益的[122]。不含CBD的纳米乳液作为空白对照配方，其活力水平与未处理的对照组没有显著差异，进一步证实了载药系统本身（油、表面活性剂和水）是生物相容的且无毒的，满足任何药物递送系统的关键要求[123]。未经包封的油中CBD的处理方法显示出中等结果，这加强了游离CBD对细胞活力有益的观点，但其效果取决于溶解度和分散性[98]。在油中，CBD的疏水性限制了其在水基细胞培养介质中的分散，从而降低了其细胞利用率，相比之下乙醇配方效果更好[124]。纳米乳液和乙醇配方之间的效果差异强调了释放动力学和配方基质在决定生物学结果方面的重要性[125]。虽然乙醇能够立即实现完全的生物利用度，但纳米乳液提供逐渐释放，虽然初始效果较弱，但确保了较低的细胞毒性风险和更长的治疗窗口[126]。这一现象说明了即时疗效与持续安全性之间的权衡：含CBD的乙醇提供强烈的但短暂的刺激，而纳米乳液则确保了持续的暴露，可能随着时间的推移降低细胞应激反应的可能性[127]。从制药角度来看，这与使用包封来缓冲活性化合物释放的配方策略一致，从而最小化可能导致副作用的峰值浓度[128]。为了确定各处理组之间的差异是否具有统计学意义，进行了方差分析（ANOVA），随后进行了Tukey事后测试[129]。如表2所示，10% DMSO处理组与其他所有组的差异非常显著（p值 = 0.0000028），这证实了其细胞毒性特征[95]。含有2% CBD的乙醇处理组也显示出与其他组相比具有统计学上的显著差异（p值 = 0.00038），这是由于其明显的增殖效应[130]。表2. 细胞毒性的Fisher多重比较测试：实验条件间的统计差异。值得注意的是，含有最佳纳米乳液、油中CBD配方、不含CBD的纳米乳液和乙醇对照组的处理在细胞活力方面没有显示出统计学上的显著差异[131]。这一结果表明，在测试条件下，这些配方均未表现出细胞毒性效应，并且所有组的细胞活力都保持在生理可接受的范围内[132]。这些发现支持这样的结论：当剂量合适时，完整的纳米乳液及其各个组分都是无毒的，并且与HaCaT细胞具有生物相容性[133]。4. 结论纳米乳液的稳定性受到微流控过程中施加的操作压力的显著影响。更高的压力会导致更有效的液滴破碎，从而产生更小、更均匀的液滴尺寸。这一效果在压力增加和微流控循环次数增加时观察到的液滴尺寸和分散度（D）的减小中得到了体现。在室温（20°C）和冷藏（4°C）下的稳定性研究表明，储存温度对纳米乳液的稳定性影响很小。两种条件下，液滴尺寸、分散度和Zeta电位相似。然而，冷藏会导致随时间出现的乳化不稳定性，因此不适合长期储存。尽管多次微流控循环可以进一步减小液滴尺寸和分散度，但能耗较高，单次循环就足以获得稳定的纳米乳液。响应表面分析确定11,000至15,000 PSI是最适合产生小而均匀液滴的最佳压力范围，更高的压力会增加能耗。牛油果油和固体浓度也显著影响了液滴尺寸和稳定性。Zeta电位作为关键的稳定性指标，表明大于30 mV的值可以防止液滴聚集。油和CBD浓度是影响Zeta电位的最关键因素，CBD的包封效率约为81.4% ± 1.5%，表明CBD在油相中的有效保留，使得纳米乳液成为一种有前景的递送系统。此外，细胞活力测定表明，最佳纳米乳液不会引起细胞死亡，并且在CBD存在下支持细胞增殖。含有2% CBD的乙醇处理方法显示出最高的细胞活力，而二甲基亚砜（DMSO）显著降低了细胞活力。纳米乳液及其各个组分未对细胞产生有害影响，进一步证实了其在进一步应用中的安全性。补充材料以下支持信息可在以下网址下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/nano16080459/s1