一种无需训练的数据稀缺海上场景分类方法：基于视觉语言模型 吴家宝 陈宇杰 陈文涛 赖一成 李俊俊 陈旭航 吴望宇

《Sensors》：A Training-Free Paradigm for Data-Scarce Maritime Scene Classification Using Vision-Language Models Jiabao Wu, Yujie Chen, Wentao Chen, Yicheng Lai, Junjun Li, Xuhang Chen and Wangyu Wu

　　摘要：柑橘衰退病毒（CTV）RNA基因组的5′-邻近区域是一个核心区域，其中包含了参与病毒生命周期不同阶段的多个元素，包括驱动病毒长非编码RNA（lncRNA）LMT1产生的序列。该区域的序列是基因组中最高度分化的区域之一，支持了病毒株之间的差异性。除了用于评估病毒群体多样性外，这一区域还为研究尽管存在序列变异，RNA结构和功能的保守性提供了宝贵的模型。在此，我们通过计算机模拟技术综合分析了八个CTV菌株的LMT1区域，并使用选择性2′-羟基酰化处理以及引物延伸和突变分析（SHAPE-MaP）技术，对来自两种不同菌株T36和T68的体外生成的LMT1 RNA进行了研究。预测的共识结构显示了19个假定的保守性茎环结构。SHAPE-MaP反应性数据支持并证实了之前未表征的15个茎环结构以及先前鉴定出的两个功能元素的预测。跨菌株的强结构保守性表明LMT1 RNA结构对其在CTV感染过程中的功能至关重要。这些结果首次提供了基于实验证据的这种病毒lncRNA的结构信息，并为理解单个RNA基序如何影响CTV的生物学特性奠定了基础。

1. 引言
柑橘衰退病毒（CTV；属于Closterovirus属，Closteroviridae科）是影响全球柑橘产业最重要的经济病毒[1,2]。CTV具有多种遗传上不同的菌株，包括T36、T68、T3、T30、VT、HA16-5、S1和RB等，这些菌株在表型上表现出显著的变异，从无症状到高毒力不等[2,3,4,5,6]。在最严重的情况下，CTV感染可导致柑橘树迅速衰退甚至死亡，全球已有数百万株植物因该病害或预防性措施而被销毁[7,8]。相反，一些温和的CTV变体不会引起可见症状，并且由于该病毒易于进行基因操作，因此有可能被用作其他柑橘病原体的治疗载体和生物控制工具[3,7,8,9]。深入理解CTV菌株的致病性和进化机制对于培育抗病品种、优化管理策略以及利用CTV作为生物工具具有重要意义。
CTV拥有一个较大的（19.3 kb）正链（+） sense RNA基因组，其中包含12个开放阅读框（ORFs），这些ORFs编码参与病毒生命周期不同阶段的蛋白质[10,11,12,13,14,15,16]。在感染过程中，CTV会产生多种不同类型的RNA，包括全长正链和负链基因组RNA、3′-末端连接的正链和负链亚基因组RNA（sgRNAs）、有缺陷的病毒基因组以及三种5′-末端连接的sgRNAs：一种是较长的LaMT RNA，另外两种是低分子量的LMT1和LMT2 RNA[17]（图1A）。基因组RNA作为翻译ORFs 1a和1b的模板，产生病毒复制所需的多聚蛋白；而3′-末端连接的正链sgRNAs则驱动位于CTV基因组3′区的基因表达，这些基因编码参与病毒颗粒组装、病毒运动和病毒与宿主相互作用的蛋白质[13,14,15,18]。值得注意的是，5′-末端连接的sgRNAs LMT1和LMT2缺乏典型的ORFs，因此被视为病毒长非编码RNA（lncRNAs）。

图1. CTV基因组的组织结构、产生的亚基因组RNA以及LMT1长度的评估：(A) CTV基因组及其产生的基因组（gRNA）和亚基因组RNA（sgRNA）的种类示意图。框内标出了病毒基因组中编码的开放阅读框或结构域。MT表示甲基转移酶；HEL表示解旋酶；RdRp表示依赖RNA的RNA聚合酶结构域；CPm和CP表示主要和次要外壳蛋白。(B) T36 LMT1 3′末端的定位图。不同颜色的箭头指向根据相应研究确定的T36 LMT1 3′末端的核苷酸位置：绿色代表Kang等人（2021）[19]的研究结果，蓝色代表Ayllon等人（2004）[20]的研究结果，橙色代表本研究中通过3′快速cDNA末端扩增（3′ RACE）技术确定的位置。每个研究中的最大箭头标记了在大多数克隆中识别为LMT1 3′末端的核苷酸位置（克隆数量以百分比显示）。(C) 通过3′ RACE技术确定T68 LMT1 3′末端。红色和橙色的箭头分别代表使用病毒感染后的Citrus macrophylla和Nicotiana benthamiana得到的结果。最大箭头表示在大多数克隆中识别为LMT1末端的核苷酸位置，克隆比例也以百分比表示。
lncRNAs是长度超过200个核苷酸（nt）的RNA转录本，不具有蛋白质编码能力，许多生物体（包括病毒）都会大量产生这类RNA[21]。近年来的大量研究表明，lncRNAs调控着重要的生物学过程，包括发育、信号传导、疾病反应以及对环境压力的响应[22]。在病毒背景下，lncRNAs已成为感染和病毒-宿主相互作用的关键调节因子。许多感染动物和植物的病毒都能编码lncRNAs，这些lncRNAs影响病毒复制、抑制宿主免疫反应并调节细胞代谢，从而为病毒感染创造更有利的环境[23,24,25]。一些植物病毒编码的lncRNAs能够对抗宿主的RNA沉默机制——这是植物的主要抗病毒防御机制，从而增强病毒的持久性[26,27]。
CTV的lncRNAs LMT1和LMT2特别值得关注，因为它们与ORF1a中的一个区域重叠，该区域已被确定为CTV菌株分类的重要标识区域[5]。CTV菌株之间的整体基因组核苷酸同一性在80.3%到92.4%之间，其中5′-邻近区域的核苷酸同一性差异最大，为72.1%到91.2%[5]。根据不同的CTV菌株，LMT1的长度在747到854 nt之间不等[19,28]，而LMT2的长度则在630到746 nt之间[28,29]。LMT1在感染早期大量产生，而LMT2则在感染后期积累。LMT2的产生机制及其在病毒感染中的作用尚不清楚，但已有研究表明LMT2的积累与病毒颗粒的组装有关[17,20,29]。相比之下，LMT1是在（-）链上的某个特定调控元件处终止基因组（+）链合成后产生的产物。从功能上讲，LMT1 RNA被认为可以抵消病毒感染宿主时由水杨酸介导的植物反应[30]。更重要的是，LMT1也被证明对于感染天然柑橘宿主至关重要，因为无法产生LMT1的CTV突变体无法建立感染[30]。此外，携带多功能p33蛋白的病毒不仅参与CTV与宿主的相互作用，还参与病毒变体间的相互作用，该蛋白能够在LMT1的201到400 nt区域以及601 nt到3′末端之间与LMT1结合[19]。鉴于CTV菌株间的序列差异，特别是在5′-邻近基因组区域，RNA的二级/三级结构而非一级序列的保守性可能对其功能产生影响。LMT1明确的生物生成途径、明显的生物学相关性及其在病毒感染中的关键作用使其成为进行二级结构分析的重要目标。

众所周知，lncRNAs与其他病毒或宿主RNA以及关键调控蛋白共同发挥作用。与许多RNA分子一样，lncRNAs会折叠成复杂的结构，这些结构通过分子内碱基配对稳定，形成夹心结构、凸起、假结和G四聚体等，这些结构可以作为大分子相互作用的支架。因此，确定lncRNAs的结构是理解其作用机制的必要步骤。研究人员通过计算预测（机器学习）和实验方法（化学结构探测）对RNA结构进行了深入研究。选择性2′-羟基酰化处理结合引物延伸和突变分析（SHAPE-MaP）技术能够实现跨转录本的高分辨率RNA灵活性分析，并将实验数据纳入折叠预测中[31,32,33]。迄今为止，尚未有任何CTV来源的RNA经过化学方法探测其二级结构，现有的CTV RNA结构研究主要集中在通过计算机建模和补偿突变来分析个别茎环结构。
在这项研究中，我们采用计算机模拟方法研究了代表八个不同菌株的CTV变体产生的LMT1 RNA的一级和二级结构。通过比较稳定且进化上保守的RNA结构，我们识别出了LMT1区域中的RNA结构基序。为了评估结构预测的准确性并支持计算机模拟分析，我们使用来自两个不同CTV菌株T36和T68-1变体的体外生成的LMT1 RNA应用了SHAPE-MaP技术。我们首先使用T36 LMT1验证了实验条件，确认了RNA的成功生成、修饰和逆转录过程。SHAPE-MaP技术获得了可重复的高分辨率数据，从而支持了二级结构的预测。多种基于热力学的算法预测LMT1会折叠成高度有序的构象，且SHAPE数据与这些预测结果一致。随后，我们将通过进化保守性识别出的基序与SHAPE分析得到的数据进行了比较。总体而言，许多假定的进化保守基序通过体外SHAPE-MaP探测得到了进一步验证，这有助于微调和完善LMT1的结构预测，同时也揭示了这种病毒lncRNA在CTV感染和病毒-宿主相互作用中的关键作用。

2. 材料与方法
2.1. T36和T68-1 LMT1的3′快速cDNA末端扩增
为了确定感染CTV T36变体（GenBank访问号# AY170468）后产生的LMT1 RNA的3′末端，使用了感染了T36感染性cDNA克隆（CTV-T36）的Nicotiana benthamiana植物作为LMT1 T36 RNA模板。N. benthamiana植物的接种方法已在先前文献中描述[35]。使用Direct-zol RNA Miniprep试剂盒（Zymo Research，Irvine，CA，USA）提取总RNA，并通过琼脂糖/溴化乙锭凝胶电泳确认RNA的完整性。根据制造商说明书，使用Escherichia coli poly（A）聚合酶（Applied Biosystems，Waltham，MA，USA）在RNA 3′末端添加poly（A）尾链。按照GeneRacer试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）提供的说明，使用SuperScript? III RT和GeneRacer Oligo dT引物进行cDNA合成。使用GeneRacer 3′引物和基于CTV-T36变体序列设计的基因特异性引物（GSP1，5′ GTA GTC CTG CAC TAC TTT G 3′）扩增LMT1的3′末端。将纯化的PCR产物克隆到pCR?-Blunt II-TOPO?载体（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）中。对19个产生的克隆的质粒DNA进行测序，并将这些序列与已知的T36 CTV LMT1序列进行比对，以确定3′末端。
为了确定T68 CTV变体（GenBank访问号# JQ965169）产生的LMT1 3′末端，使用了感染了杂交病毒CTV-L1L2T68（基于T36 cDNA克隆改造，其中108到3012 nt之间的区域被替换为T68-1基因组的相应区域）的N. benthamiana植物，以及感染了野生型T68-1的C. macrophylla植物作为3′ RACE的模板。cDNA合成和PCR过程与上述相同，使用的引物包括GeneRacer Oligo dT引物、GeneRacer 3′引物和基于CTV T68-1序列设计的基因特异性引物（GSP2，5′ CAG GTC CTC GGC TTT CGC TGT ACG 3′）。从携带T68-1 LMT1序列的20个克隆中提取质粒DNA，并对其进行测序，以确定T68-1 LMT1的长度。为了进一步验证N. benthamiana的结果，使用感染了野生型T68-1 CTV的柑橘植物提取的总RNA作为3′ RACE的模板，对生成的27个克隆进行测序以确定3′末端。
2.2. LMT1质粒的构建
使用pCTV-T36作为模板，通过PCR扩增了两种T36 LMT1序列变体：一种包含CTV基因组5′末端区域的1到750 nt，另一种包含1到794 nt；然后使用限制内切酶StuI和EcoRI（New England Biolabs，Ipswich，MA，USA）将这些片段克隆到pUC19载体质粒中，位于T7启动子之下。用于克隆的寡核苷酸序列见表1。在LMT1序列的5′末端添加了两个额外的非病毒鸟嘌呤残基，以促进T7 RNA聚合酶的有效转录。T68-1 LMT1序列含有794个5′端核苷酸，通过逆转录（RT）-PCR从感染CTV T68-1的C. macrophylla植物中提取的总RNA扩增，并使用特定的寡核苷酸引物克隆到pUC19载体上，同时引入T7启动子，利用StuI和EcoRI酶进行克隆。用于克隆的引物序列见表2。在T68-1 LMT1序列的5′端 additionally 添加了两个非病毒性鸟嘌呤残基，以促进T7 RNA聚合酶的有效转录。表1列出了用于生成SHAPE-MaP质粒构建、逆转录和文库构建的引物。表2列出了用于生成LMT1截短片段、T68 LMT1质粒以及RT-PCR检测的引物。

2.3 LMT1 RNA的生成
为了生成用于SHAPE-MaP分析的LMT1 RNA，按照以下方法进行体外转录：首先使用EcoRI酶（New England Biolabs，Ipswich，MA，USA）将每个pUC19 LMT1质粒线性化，该酶可切割质粒以生成具有正确3′端核苷酸的模板，而不添加任何非病毒性碱基。根据制造商的说明（QIAGEN，Germantown，MD，USA），使用QIAquick? PCR纯化试剂盒纯化线性化的质粒。留取50 ng的线性化模板用于凝胶分析。纯化后，按照制造商的说明（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA），使用mMESSAGE mMACHINE? T7转录试剂盒进行体外转录。由于发现LMT1没有帽结构，因此在转录过程中使用了不含帽的rNTP混合物（New England BioLabs，Ipswich，MA，USA）。然后将1 μg的线性化质粒在37°C下孵育2小时，总孵育体积为20 μL。留取1 μL的RNA和DNA混合物用于凝胶分析。新转录的RNA在37°C下用1 μL的TURBO? DNase处理15分钟以去除DNA模板（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）。之后，将经过DNase处理的RNA用于凝胶分析。使用ZYMO RNA Clean & Concentrator试剂盒（ZYMO，Irvine，CA，USA） cleanup RNA，并保留1 μL的纯化RNA用于凝胶分析。使用1%琼脂糖凝胶评估RNA生成的各个步骤。根据制造商的说明（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA），使用Qubit?荧光计进行RNA定量。

2.4 RNA折叠、修饰和逆转录
为了折叠、修饰和分析RNA，采用Smola等人（2015）[31]描述的程序，并进行了部分修改。简要来说，将5 pmol的转录RNA加入12 μL的无菌水中。然后将RNA在95°C下孵育2分钟使其变性，随后立即置于冰上冷却2分钟。接着向RNA中加入6 μL的3.3×折叠缓冲液（333 mM HEPES（pH 8.0）、333 mM NaCl、33 mM MgCl2），通过移液器混合后，让RNA在25°C下折叠20分钟。由于植物病毒RNA的生物学特性，这里使用25°C而非37°C进行折叠。将9 μL的折叠RNA置于5%的游离聚丙烯酰胺凝胶（10× TBE缓冲液（1 M Tris、0.9 M硼酸、0.01 M EDTA）、30%聚丙烯酰胺和双丙烯酰胺溶液、TEMED以及10%过硫酸铵溶液中，然后在冰上以120 V的电压电泳105分钟。电泳后用溴化乙啶染色5分钟，并在紫外光下观察结果。

折叠完成后，通过将9 μL的折叠RNA分别与1 μL的200 mM 2-甲基烟酸咪唑烷（NAI）或1 μL的二甲基亚砜（DMSO）混合来修饰RNA。修饰反应在25°C下进行15分钟，之后置于冰上。根据制造商的说明（New England Biolabs，Ipswich，MA），使用Monarch RNA纯化试剂盒纯化RNA。然后使用Qubit?荧光计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）进行RNA定量。

逆转录反应按以下步骤进行：新鲜配制5× RT缓冲液（250 mM Tris-HCl（pH 8.3）、375 mM KCl、15 mM MnCl2）。用于确认能否转录整个修饰RNA的两种不同RT引物见表1。将1 pmol的RNA样品与1 μL的10 mM dNTPs（New England BioLabs，Ipswich，MA）和1 μL的表1中列出的2 μM引物混合，在热循环仪中65°C孵育5分钟，然后迅速冷却至冰上。接着加入4 μL的5× RT缓冲液、2 μL的0.1 M DTT和1 μL的SUPERase-IN?（RNase抑制剂，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA），在25°C下孵育2分钟。最后向每个管中加入1 μL的Superscript II逆转录酶（200 U/μL；Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）。样品在热循环仪中的条件为：25°C孵育10分钟，42°C孵育3小时，70°C孵育15分钟，最后在12°C下保温。cDNA通过Microspin? G-50柱子（Cytiva，Marlborough，MA，USA）进行纯化。

2.5 SHAPE-MaP文库构建和测序
逆转录后，进行两次独立的PCR反应以生成SHAPE-MaP文库。每次反应的引物见表1。第一次PCR步骤如下：将5 μL的纯化cDNA与10 μL的Q5反应缓冲液、1 μL的dNTPs（各10 mM）、Step 1的正向和反向引物（各10 μM）、0.5 μL的Q5热启动DNA聚合酶（2 U/μL）以及无核酸酶的水混合至最终体积50 μL。然后在热循环仪中按照以下条件孵育：98°C预热30秒，接着进行5次循环：98°C预热10秒、65°C预热30秒、72°C预热20秒，72°C延伸2分钟，最后在12°C下保温。反应产物使用PureLink? PCR Micro试剂盒纯化，并在10 μL的无核酸酶水中洗脱（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）。

第二次PCR步骤如下：将10 μL的纯化PCR产物与10 μL的Q5反应缓冲液、1 μL的dNTPs（各10 mM）、Step 2的正向和反向引物（各10 μM）、0.5 μL的Q5热启动DNA聚合酶（2 U/μL）以及无核酸酶的水混合至50 μL。然后在热循环仪中按照以下条件孵育：98°C预热30秒，接着进行25次循环：98°C预热10秒、65°C预热30秒、72°C预热20秒，72°C延伸2分钟，最后在12°C下保温直至下一步。用于文库生成的带条形码引物见表3。文库使用Agencourt AMPure XP珠子（Beckman Coulter，Brea，CA，USA）进行纯化。将AMPure珠子恢复至室温并充分涡旋后使用。向每个反应中加入45 μL的珠子并混合。珠子混合物在室温下孵育5分钟，然后放置于磁力架上直至所有珠子聚集在磁铁周围。去除上清液，用新配制的80%乙醇清洗珠子三次。去除多余的乙醇，然后将珠子风干。从磁力架上取下样本，并加入17 μL的无核酸酶水重新悬浮珠子；在室温下孵育2分钟，再次放置于磁力架上，将15 μL的上清液转移到新的试管中。使用Qubit?荧光计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）进行文库浓度定量，并使用宽范围DNA检测方法（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）分析文库片段大小。第一组含有750个核苷酸的T36 LMT1 RNA文库在佛罗里达大学跨学科生物技术研究中心（ICBR）的Illumina MiSeq 2 × 250平台上进行测序。下一组含有794个核苷酸的T36和T68-1 LMT RNA文库在ICBR的Illumina MiSeq 2 × 300平台上进行测序。

2.6 SHAPE图谱的生成和结构预测
所有比较均使用NAI处理的RNA和DMSO处理的对照RNA进行。处理后的fastq文件经过trimming以去除引物序列，并合并每个样本的两个扩增产物以覆盖整个LMT1序列。所有文库使用ShapeMapper2管线生成SHAPE反应性图谱，并使用Superfold 1.0生成Shannon熵图谱[33,37]。结构分析使用RNAstructure程序（版本6.4）[38]、ViennaRNA RNAfold网页服务器（http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi，访问日期2025年2月12日）[39,40]和RNAcanvas网页应用程序（https://rna2drawer.app/，访问日期2025年2月12日）[41]进行。

3 结果
3.1 T36和T68-1 CTV变体感染后产生的LMT1 RNA 3′端的确定
对于不编码多肽的长链非编码RNA（lncRNAs），RNA结构可能是其功能的关键决定因素。为了识别LMT1中的潜在功能性区域并比较不同CTV菌株间的差异，我们从八种CTV基因型（RB（FJ525433.1）、T36（AY170468.1）、HA16-5（GQ454870.1）、S1（KU589212.1）、T68-1（JQ965169.1）、T30（EU937520.1）、VT（DQ151548.1）和T3（KC525952.1）中各选取一个代表菌株，对其LMT1 RNA进行计算机模拟结构保守性预测。

为了确定用于比较的LMT1 RNA的准确核苷酸长度，我们通过3′ RACE技术从感染相应病毒的植物中提取的RNA，实验性地确定了T36和T68-1变体代表的LMT1的3′末端。T36 LMT1的3′末端之前已被测定；但T68-1 LMT1的3′末端尚未确定。Ayllon等人的研究[20]显示，大多数携带T36 LMT1序列的克隆的3′末端位于T36基因组RNA 5′末端的第765位。相比之下，Kang等人的研究[19]使用病毒p33蛋白 pull-down技术将T36 LMT1的长度确定为最多747个核苷酸。在这里，我们再次评估了T36 LMT1的3′末端。大多数克隆（19个中的10个）的3′末端位于第765位，与Ayllon等人的研究结果一致；但另有4个克隆的3′末端位于第793位，表明T36 LMT1 RNA可能具有更长的长度（图1B）。接下来，我们对感染了基于T36 cDNA克隆构建的杂交病毒（其中108到3012位核苷酸区间被替换为T68-1基因组的相应区域[CTV-L1L2T68；[36]）的N. benthamiana植物以及感染野生型T68-1的柑橘植物进行了3′ RACE分析。由于无法获得T68-1的原始病毒，我们使用了含有T68-1 LMT1大部分核苷酸序列及其下游调控元件（负责LMT1产生的元件）的杂交病毒cDNA克隆来感染N. benthamiana植物。从该实验室宿主中提取的RNA用于3′ RACE分析。随后，使用从T68-1感染的C. macrophylla中提取的RNA进行了进一步的3′ RACE分析。结果表明，T68-1 LMT1的最大长度为794个核苷酸对（nt）（见图1C）。使用被CTV-L1L2T68感染的N. benthamiana获得的12个克隆（共20个）均映射到T68-1基因组中的nt 794位置。相比之下，使用T68-1感染的柑橘植物分析的27个克隆中有13个映射到nt 793位置，另有2个映射到nt 794位置（见图1C）。基于以上结果，我们使用了每个选定病毒基因组的5′末端794个核苷酸对进行比较，因为这反映了T36或T68-1 LMT1 RNA的最大长度。

3.2. 基于八个CTV菌株共识的LMT1基序的LocARNA预测
使用locARNA比对?服务器分析了八个CTV菌株代表性变体的LMT1序列，该服务器采用同时比对和折叠算法来预测保守的RNA结构[42]。如图2A所示，LMT1的多个区域具有结构保守性，这一点通过比对顶部的共识点括号表示法得以体现。不同颜色用于突出显示各个区域，反映了每个位置观察到的碱基对类型数量（最多为六种：A:U、U:A、G:C、C:G、G:U和U:G），颜色强度表示序列间的保守性。绿色阴影的核苷酸具有保持碱基对相互作用的序列变异，从而为相应区域的结构提供了额外的支持。

3.2. 基于八个CTV菌株共识的LMT1基序的LocARNA预测
使用locARNA比对?服务器分析了八个CTV菌株代表性变体的LMT1序列，该服务器采用同时比对和折叠算法来预测保守的RNA结构[42]。如图2A所示，LMT1的多个区域具有结构保守性，这一点通过比对顶部的共识点括号表示法得以体现。不同颜色用于突出显示各个区域，反映了每个位置观察到的碱基对类型数量（最多为六种：A:U、U:A、G:C、C:G、G:U和U:G），颜色强度表示序列间的保守性。绿色阴影的核苷酸具有保持碱基对相互作用的序列变异，从而为相应区域的结构提供了额外的支持。

3.3. 使用SHAPE-MaP分析CTV LMT1结构
为了实验验证保守的LMT1 RNA结构，我们采用了SHAPE-MaP方法。SHAPE探针通过一种酰化试剂探测核糖骨架，该试剂与未配对的核苷酸反应，而与核碱基的身份无关。MaP依赖于逆转录酶在SHAPE加合物位置诱导突变的能力，随后通过测序进行鉴定（见图3A）。这允许识别每个分子中的多个加合物以及单个分子内的结构变化。由于LMT1与CTV基因组共末端，我们使用了体外转录的LMT1来避免基因组RNA的干扰。

3.4. SHAPE-MaP证实LMT1序列中的茎环结构
然后我们使用SHAPE-MaP方法证实了LMT1序列中的茎环结构。SHAPE探针通过一种酰化试剂探测核糖骨架，该试剂与未配对的核苷酸反应，而与核碱基的身份无关。MaP依赖于逆转录酶在SHAPE加合物位置诱导突变的能力，随后通过测序进行鉴定。这允许识别每个分子中的多个加合物以及单个分子内的结构变化。由于LMT1与CTV基因组共末端，我们使用了体外转录的LMT1来避免基因组RNA的干扰。

3.5. 使用SuperFold分析CTV LMT1的二级结构
为了使用SuperFold分析CTV LMT1的二级结构，我们采用了该工具。SuperFold利用ShapeMapper的输出来模拟RNA的二级结构，高概率的配对相互作用用绿色箭头表示。SuperFold还提供了Shannon熵值，低熵值表示更有可能形成稳定的结构或保持未配对状态。通过比较T36和T68-1 LMT1的两种较长和较短的异构体，我们发现它们的全局结构轮廓没有显著差异。新发现的基于共识结构预测和SHAPE-MaP分析的结构

接下来，我们利用基于结构的locARNA预测作为参考，比较了在T36和T68-1变体的LMT1序列中识别出的15个stem-loop结构。为了便于比较，我们将这些stem-loop任意分为了六个预测的结构段，分别称为段1（nt 106–166）、段2（nt 167–277）、段3（nt 278–362）、段4（nt 388–463）、段5（nt 561–592）和段6（nt 672–720）（见图5）。如图5所示，SHAPE-MaP分析支持15个预测的stem-loop中的12个的保守性，只有三个预测结构（段2、3和4）存在显著变异。段1由两个发夹环组成，其中包含较小的内部环，在每种病毒变体的SHAPE-MaP结构中得到了细化。对于段2，SHAPE-MaP结构表明在T36和T68-1的LMT1 RNA谱型中存在多个具有反应性的核苷酸，这些核苷酸延长了缩短的第二个stem-loop两侧的未配对灵活区域。此外，第四个stem-loop得到了T68-1来源的LMT1数据的支持，但在T36中的构象有所不同。段3的第三个stem-loop存在变异，SHAPE反应性数据在两种变体的LMT1 RNA之间有所不同，表明其发夹构象不同。对于段4，SHAPE-MaP数据显示第二个stem-loop比基于保守性的预测要短，第三个stem-loop的结构在两种CTV变体之间也有所不同。在段5和段6中，SHAPE反应性支持基于结构保守性的预测。

图5. 来自LMT1区域的15个新鉴定stem-loop的结构比对和SHAPE细化结构。左侧面板显示了基于结构引导的比对（使用locARNA生成）得到的预测结构，右侧面板显示了通过SHAPE-MaP得到的细化结构。这些细化结构使用了T36和T68-1的LMT1。基于结构的stem-loop中的彩色碱基代表碱基对的兼容性。在SHAPE信息模型中，高反应性的碱基（>0.85）用红色突出显示，中等反应性的用橙色（>0.4, <0.85）突出显示，低反应性的用黑色（<0.4）突出显示。为了便于讨论，区域（1–6）是任意定义的，相应的核苷酸位置在左侧面板中标出。洋红色星号表示环中常见的CUG基序。蓝色下划线表示SHAPE衍生的结构与结构引导的比对不同的区域。对鉴定出的LMT1 stem-loop末端环序列的分析显示，在两种CTV变体的多个结构中都存在重复的CUG基序。在T36 LMT1中，15个环中有7个包含CUG序列，而在T68-1 LMT1中，15个环中有8个显示出CUG模式。进一步比较表明，七个含有CUG的环在两种变体的LMT1二级结构中位于相同位置，显示出位置上的保守性。含有CUG基序的环大小从4到9个核苷酸不等，并聚集在LMT1的中央部分，即段2、3和4（nt 167–463）内。在所有情况下，SHAPE-MaP反应性谱型都支持这些stem-loop的形成。鉴于它们的广泛保守性，这15个新鉴定的stem-loop代表了研究LMT1功能的有趣元素。

从SHAPE-MaP数据中得出的另一个有趣发现是与ORF1a起始密码子上游立即缺乏结构的保守性有关，ORF1a的部分序列存在于LMT1中。如图6A所示，这一区域的长度和一级序列在不同菌株的变体中有所不同，尽管所有序列至少含有50%的腺嘌呤残基。T36和T68-1的这一区域的反应性谱型如图6B所示，显示出高反应性，表明该序列的未配对性质。病毒经常使用非典型的翻译模式，包括内部核糖体进入位点（IRESs）。通常，这些是高度结构化的元素；然而，研究表明芜菁皱缩病毒使用一种富含腺嘌呤且无结构的IRES来产生其包膜蛋白[45]。与CTV ORF1a相邻的富含腺嘌呤的无结构区域的位置很有趣，它可能以类似的方式发挥作用。鉴于LMT1是非编码的，但与CTV基因组5′-端接，这个区域可能允许LMT1将某些相互作用因子从基因组中分离出来，从而影响复制和翻译的时间。

图6. ORF1a起始密码子上游保守区域的结构分析：(A) 使用locARNA结构引导的ORF1a起始密码子上游区域的多个序列比对。分析使用了八个CTV菌株的代表样本。菌株名称显示在对比图的左侧。碱基根据兼容的碱基对类型进行着色。(B) 基于SHAPE-MaP信息的ORF1a起始密码子上游区域的二级结构。高反应性的碱基（>0.85）用红色突出显示，中等反应性的（>0.4, <0.85）用橙色突出显示，低反应性的（<0.4）用黑色突出显示。蓝色下划线标记了ORF1a的起始密码子。结合使用保守信息的计算机预测和两种CTV菌株代表样本的实验RNA结构分析，揭示了LMT1中的多个新结构以及ORF1a附近的一个保守的灵活区域。未来的研究将需要揭示这些元素在LMT1介导的途径中的作用。

4. 讨论

lncRNA是一类宽度多样的RNA分子，广义上定义为长度超过200个核苷酸且缺乏典型蛋白质编码能力的转录本。尽管最初由于表达水平低、检测率低以及总体序列保守性差而被认为是转录噪声[44,46]，但现在lncRNA被认为是基因表达的重要调节因子。与信使RNA（mRNA）类似，lncRNA也可能被加帽、切割和多聚腺苷酸化，但它们主要通过与DNA、RNA和蛋白质的相互作用来调节基因表达[47,48,49]。因此，lncRNA已被证实参与了许多生物学过程，包括染色质重塑、转录调控、RNA剪接和转录后控制[50,51,52,53]。RNA分子的功能与其结构密切相关。特别是病毒RNA，依赖于特定的二级和三级结构，如stem-loop、假结、 kissing loops、长距离RNA-RNA相互作用以及动态构象变化[54,55]。病毒RNA基因组的结构介导了它们与蛋白质、RNA和其他分子伴侣的相互作用，有效控制了病毒感染周期和宿主相互作用的动态[54,56,57,58]。通常，RNA的关键调控结构是保守的，因此识别这些保守的结构基序——尤其是那些通过补偿性突变维持的基序——提供了确定功能相关元素的强大手段。

在这项工作中，我们将SHAPE-MaP应用于CTV lncRNA LMT1，以实验性细化其二级结构。这种方法使我们能够验证预测的基序，并生成一个基于SHAPE的二级结构预测，为未来的功能研究提供了一个框架。重要的是，这种实验约束模型为突变分析提供了基础，可以在探索单个基序的作用的同时保持全局RNA结构。这种类型的分析已经导致在许多背景下识别出对病毒适应性至关重要的新结构，包括在人类免疫缺陷病毒（HIV）、丙型肝炎病毒（HCV）、辛德比斯病毒（SINV）和登革热病毒（DENV）的RNA分子中发现的结构[54]。例如，对HIV-1和两种HIV前体菌株（SIVcpzMB897和SIVmac239）的全基因组SHAPE比较显示了保守的功能性和物种特异性元素[54,59]。在HCV的研究中，发现了病毒复制和产生传染性病毒所需的不同元素，强调了在不同病毒感染阶段具有不同作用和参与的结构基序[54,60,61]。在像SINV这样的甲病毒中，结构元素在不同物种间并不保守，但在SINV中得到SHAPE反应性支持的结构元素尽管不保守，但仍显示出对病毒适应性的关键作用[54,62]。最后，DENV2基因组的SHAPE探索揭示了对病毒适应性和基因组结构重要的三级结构元素[54,63,64]。这些研究中的许多表明，以前未表征的病毒基因组中的RNA结构在病毒家族中是必不可少的。

在这项研究中，计算机模拟和SHAPE-MaP分析的结合提供了来自多种CTV菌株的LMT1 lncRNA的首批高分辨率二级结构图。通过利用八种CTV菌株的结构保守性，我们识别出19个潜在的stem-loop，包括在5′和3′末端之前已经表征的两个元素。我们通过对T36和T68菌株的代表样本使用SHAPE-MaP验证了15个新结构。SHAPE反应性谱型的高度可重复性和相应的低SHAPE、低香农熵值突显了结构预测的稳健性。本研究的主要目标是，几个stem-loop在两种菌株产生的不同LMT1 RNA中都是保守的，并且包括为了保持结构元素而进行的补偿性核苷酸变化。这表明，LMT1区域的RNA结构，而不仅仅是初级序列，可能受到选择压力，并且对LMT1的功能至关重要。

在这项研究中识别出的几个具体结构特征值得进一步研究。多个末端环中的重复CUG基序引人关注，因为它可能表明是宿主或病毒RNA结合蛋白的重复结合位点，尽管同样有可能是其功能重要性在于stem-loop的大小和结构本身。此外，在ORF1a上游发现的富含腺嘌呤的高度SHAPE反应性、灵活区域提示了一种可能影响翻译和涉及的RNA–蛋白质相互作用的调节元素，这让人联想到其他病毒中的无结构IRES元素。总的来说，这些发现不仅扩展了我们对这种lncRNA在CTV感染中的结构和功能的理解，也为未来旨在定义特定RNA基序在CTV复制、基因表达和病毒–宿主相互作用中作用机制的研究奠定了基础。一个需要解决的重要问题是LMT1序列与CTV基因组RNA和lncRNA LMT2的重叠。有可能一些观察到的结构是在后者RNA分子层面发挥作用的，而不是在LMT1中。进一步对相应区域的RNA进行体内分析对于辨别它们的生物学作用非常重要。这种分析还可能揭示诸如m6A（N6-甲基腺苷）这样的核苷酸修饰，这些修饰可能影响结构。

我们的发现将LMT1归类为越来越多具有功能的病毒lncRNA之一，并强调了RNA结构作为探索作用机制的手段。通过为LMT1提供实验支持的结构框架，这项研究为未来旨在定义RNA基序及其在病毒复制、宿主相互作用和CTV菌株相互作用中的功能的研究奠定了基础。最后，这项工作展示了可作为抗病毒药物靶点的结构化RNA基序。

补充材料

以下支持信息可以在以下网址下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/v18040470/s1
- 图S1：(A) 在Clustal-omega中对齐的CTV菌株的全RNA基因组序列的系统发育分析，(B) 使用Clustal-omega对齐的LMT1（794个核苷酸）RNA序列，(C) 通过locARNA结构比对对齐的LMT1（794个核苷酸）RNA序列，(D) 使用Clustal-omega对齐的p23亚基因组RNA序列，以及(E) 使用locARNA结构比对对齐的p23亚基因组RNA序列；
- 图S2：T36的LMT1的SHAPE-MaP分析的可重复性；
- 图S3：T68-1的LMT1的SHAPE-MaP分析的可重复性。