《Horticulturae》：Development of a CRISPR/Cas9 Platform in Datura inoxia for Disrupting Tropane Alkaloid Biosynthesis to Generate Non-Toxic Germplasm
Xianfang Zou,
Tianxing Yuan,
Yuxin Zhang,
Xiaohan Zhang,
Guoqing Niu and
Yulong Guo
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本研究旨在解决蔓陀罗属植物因其组织中含有高毒性托烷类生物化物如天仙子胺和莨菪碱，导致其园艺应用存在安全风险的问题。为此，研究人员成功在Datura inoxia中建立了高效的农杆菌介导的CRISPR/Cas9基因组编辑平台，并靶向敲除了托烷类生物碱生物合成通路中的两个关键基因LS和CYP80F1。所得突变体植株完全检测不到天仙子胺和莨菪碱，且生长正常，形态与野生型无异。该工作首次在蔓陀罗属中建立了基因组编辑平台，并创制了首批无毒性种质，为蔓陀罗的安全园艺化育种提供了关键的基因资源和功能性工具。
蔓陀罗是一种极具观赏性的植物，拥有优雅挺拔的身姿和醒目的喇叭状花朵，其中D. inoxia更是以其强烈的夜间芬芳而闻名。然而，这份美丽背后隐藏着致命的风险——包括天仙子胺和莨菪碱在内的强效托烷类生物碱遍布其全身。一旦被人或家畜误食，便可能引发致命的抗胆碱能中毒，从幻觉、心动过速到呼吸衰竭，后果严重。正是这种毒性，使得蔓陀罗的园艺应用受到严格限制甚至被禁止，其巨大的观赏价值被长期“封印”。如何解除这种“美丽”的毒性，让蔓陀罗安全地走进花园和景观，成为了一个亟待解决的难题。
传统的植物功能研究和育种手段在面对像蔓陀罗这样的“棘手”物种时，往往显得力不从心。虽然其生物碱合成通路关键基因，如利托林合成酶(LS)和利托林变位酶(CYP80F1)，已被解析，但在蔓陀罗中实现稳定、可遗传的基因组编辑，以精准阻断毒性物质的合成，一直是一个未突破的技术瓶颈。针对这一问题，研究团队决心“攻坚”，目标是在蔓陀罗中建立起一个高效的CRISPR/Cas9基因编辑平台，并以此创制出无毒性的种质资源。相关研究成果已发表于期刊《Horticulturae》。
研究人员为达成目标，综合运用了几项关键技术。他们首先为D. inoxia建立了一个高效、无需生长素的新型芽再生系统，为后续转化奠定了基础。在此基础上，优化了农杆菌介导的稳定遗传转化流程，实现了超过50%的转化效率。研究团队构建了针对LS和CYP80F1基因的CRISPR/Cas9敲除载体，并将其转化至D. inoxia的叶片外植体中，通过草铵膦筛选和分子鉴定，成功获得了转基因株系。最后，利用高效液相色谱和高分辨质谱，对突变体植株叶片中的托烷类生物碱进行了定性与定性的代谢分析。
3.1. Establishment of a Regeneration System for D. inoxia
通过对多种植物激素组合的测试，研究人员发现仅包含TDZ和6-BA这两种细胞分裂素的培养基组合，在不需要添加生长素的情况下，就能从叶片外植体中高效诱导不定芽再生。其中，含有1.0 mg/L TDZ和0.5 mg/L 6-BA的培养基效果最佳，平均每个外植体可产生超过7个不定芽，成功建立了一个高效的植株再生系统。
3.2. Construction of CRISPR/Cas9 Vectors for DiLS and DiCYP80F1 Knockout
研究人员基于D. stramonium的基因序列，在D. inoxia中成功克隆了LS和CYP80F1的编码序列。他们分别为两个基因设计并构建了CRISPR/Cas9敲除载体pGEKls和pGEKcyp80f1。其中，LS的sgRNA靶点位于其第三个外显子，CYP80F1的sgRNA靶点位于其第一个外显子。这些载体用于后续的遗传转化。
3.3. Generation of Dils and Dicyp80f1 Mutants
利用建立的再生和转化体系，研究人员将构建的CRISPR/Cas9载体转化至D. inoxia中，最终分别获得了49个（LS载体）和36个（CYP80F1载体）独立的抗性株系。对其中部分株系的测序分析表明，LS的基因编辑效率为53%（15个中8个有突变），而CYP80F1的编辑效率达到了100%（12个中12个有突变），两者差异具有统计学意义。突变类型主要为小的插入或缺失。在控制条件下，无论是ls突变体还是cyp80f1突变体，其生长、株高、叶片和花果形态，都与野生型植株没有明显差异。
3.4. Ablation of Hyoscyamine and Scopolamine in Mutant Plants
通过高效液相色谱分析发现，在野生型植株叶片的提取物中，可以在9.4分钟和11.4分钟处分别观察到清晰的莨菪碱和天仙子胺色谱峰。然而，在ls和cyp80f1突变体植株的叶片提取物中，这两个特征峰完全消失了。进一步的质谱分析证实，在突变体样品中未能检测到对应于莨菪碱标准品[M+H]+离子峰（m/z 304.1547）的信号。这些结果表明，敲除LS或CYP80F1基因有效地阻断了天仙子胺和莨菪碱的生物合成。
本研究成功地在蔓陀罗中建立了一个高效的CRISPR/Cas9基因组编辑平台，并利用该平台精准敲除了托烷类生物碱生物合成通路中的两个关键基因——LS和CYP80F1。代谢组学分析证实，突变体植株中已完全检测不到有毒的天仙子胺和莨菪碱，而植株的生长发育和观赏形态未受任何影响。这标志着首例在蔓陀罗属植物中实现的稳定基因组编辑，并成功创制了首批无毒性种质资源。
这项工作具有多方面的重要意义。在应用层面，它为培育安全的蔓陀罗观赏品种奠定了直接的种质和技术基础，有望解决因毒性问题而长期受限的园艺应用瓶颈。在技术层面，所建立的、不依赖生长素的再生体系和高效率的农杆菌转化与CRISPR/Cas9编辑平台，填补了蔓陀罗属生物技术领域的长期空白，为后续在该属植物中进行功能基因组学研究（如果实类型进化、物种分化等）和性状改良（如花色、花型）提供了强大的工具。在科学层面，研究结果确证了LS和CYP80F1是D. inoxia托烷类生物碱合成通路中不可或缺、且不存在功能冗余的关键节点，为理解该代谢通路提供了新的功能证据。该研究展示了现代基因组编辑技术在精准、高效地解除观赏植物生物安全风险方面的巨大潜力。
