《Current Issues in Molecular Biology》：Rapid and Efficient Creation of Sweet–Waxy Maize Germplasm via CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing of Sh2 and Wx
Xiaolan Yan,
Junnan Li,
Huijian Liu,
Wenfei Jia,
Guojun Gao,
Yongtian Qin,
Longxiang Guan,
Xiaxia Duan,
Jialu Xu and
Hongqiu Wang
+ 10 authors
编辑推荐：
本研究针对传统育种创制甜糯玉米周期长、存在连锁累赘等问题，利用CRISPR/Cas9技术对淀粉合成通路关键基因Sh2和Wx进行编辑，获得了无Cas9的T3纯合突变体，并成功培育出同一果穗甜、糯籽粒按3:1分离的新种质，为特种玉米高效育种提供了新策略。
背景：玉米市场的“双重诱惑”与育种困境
在追求食物多样化的今天，鲜食玉米早已超越了“饱腹”的单一功能，甜玉米的爽脆多汁与糯玉米的软糯Q弹各有拥趸。市场因此催生了对兼具两者优点的“甜糯玉米”的需求——这种特种玉米在同一果穗上能同时结出甜粒和糯粒，实现了口感的“一穗双享”。然而，这种理想型的培育在传统育种中却面临巨大挑战。
甜玉米（通常由sh2等基因突变导致淀粉合成受阻、糖分积累）和糯玉米（由wx基因突变导致直链淀粉缺失、几乎全为支链淀粉）分别受不同隐性基因控制。传统方法需通过多代回交将这两个优良等位基因导入同一自交系，过程不仅耗时长达6-7年，更棘手的是会引入“连锁累赘”（linkage drag）——即随着目标基因一同导入的不良基因片段，往往导致最终品种产量下降或农艺性状劣化。如何快速、精准地“组装”这些优良性状，同时避免不良基因的干扰，成为特种玉米育种的核心瓶颈。
技术路线概览
本研究以玉米骨干自交系B104和C01为受体，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，分别针对Sh2（调控超甜性状）和Wx（调控糯性性状）基因设计sgRNA，通过农杆菌介导法获得转基因植株。经过连续自交筛选，获得了不含外源Cas9基因的T3代纯合突变体，并进一步通过杂交组合，成功创制出甜、糯籽粒按3:1比例分离的新型甜糯玉米种质。
研究结果解析
3.1. 靶点克隆与基因编辑株系获得
研究人员首先利用CRISPOR软件在Sh2基因的第6、8外显子和Wx基因的第2、8外显子设计了特异性sgRNA靶点，构建了pBUE411双靶点CRISPR/Cas9载体。通过农杆菌介导转化，在C01背景中获得了6株Sh2编辑的T0代植株，在B104背景中获得了5株Wx编辑的T0代植株，经PCR验证确认了转基因阳性。
3.2. T1代编辑位点特征分析
对T1代纯合编辑株系进行测序分析，发现Sh2编辑株系在靶点1和2分别出现了4种和6种不同的突变类型（如1 bp插入、2 bp缺失等）；Wx编辑株系则分别出现了5种和3种突变类型，甚至出现了长达290 bp和349 bp的大片段缺失。所有突变均发生在PAM序列上游，证实了CRISPR/Cas9系统在玉米中的高效编辑能力。
3.3. Cas9-Free T3代Sh2突变体表型
经过连续自交淘汰，筛选出两份不含Cas9的Sh2纯合突变体（sh2-c1, sh2-c2）。突变导致AGPase（ADP-葡萄糖焦磷酸化酶）大亚基被截断，功能丧失。表型上，突变体籽粒成熟后呈现典型的“超甜”皱缩透明状，纵切面显示胚乳因淀粉填充不足而出现空隙。生化检测证实，突变体籽粒的可溶性糖含量显著高于野生型，而株高、穗位高等主要农艺性状无显著差异，证明了编辑的专一性。
3.4. Cas9-Free T3代Wx突变体表型
同样获得了两份Wx纯合突变体（wx-c1, wx-c2），其GBSS I（颗粒结合淀粉合成酶I）被截断，导致直链淀粉合成受阻。突变体籽粒外观暗淡呈蜡质，透光性差。碘染结果显示，野生型胚乳呈深蓝色（直链淀粉反应），而突变体呈浅棕褐色（支链淀粉反应）。淀粉含量测定表明，突变体胚乳中支链淀粉（amylopectin）含量显著升高，农艺性状同样保持稳定。
3.5. 甜糯玉米新种质的创制
利用上述无外源基因的纯合突变体进行杂交组合设计：将sh2纯合体与wx纯合体杂交，在自交后代中筛选出双隐性纯合体（sh2sh2wxwx）作为P1亲本，与wx单突变体（SH2SH2wxwx, P2）杂交。F1代（SH2sh2wxwx）自交后，成功获得了甜糯复合型果穗（SW1, SW2）。由于Sh2和Wx独立遗传，果穗上的籽粒按3（糯性）:1（甜性）的比例分离，且未观察到连锁累赘现象。
结论与意义
本研究成功建立了一套基于CRISPR/Cas9的甜糯玉米快速育种技术体系。通过精准编辑Sh2和Wx基因，不仅显著缩短了育种周期（从传统方法的数年缩短至数代），更重要的是实现了“无痕”编辑，获得了不含外源DNA且农艺性状优良的纯合种质。研究证实，基因编辑可以有效打破连锁累赘，在改良目标性状的同时保持品种的原有优良背景。这为特种玉米乃至其他作物的多性状聚合育种提供了高效、安全的新范式，具有重要的产业应用价值。
