乳酰化修饰调控的关键基因鉴定及其在乳腺癌肿瘤免疫微环境中的作用分析

《Current Issues in Molecular Biology》：Identification of Key Genes Regulated by Lactylation Modification and Associated with Tumor Immune Microenvironment in Breast Cancer Yaohong Xie, Yi Ge, Na Miao, Pengxia Zhang and Jiaqi Xia

　　

甜糯玉米是一种具有较高市场价值的特种玉米类型，其市场需求不断增长，但传统甜糯玉米育种方法受制于育种周期长、连锁累赘等瓶颈。本研究旨在利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术快速创制甜糯玉米种质。研究人员采用CRISPR/Cas9系统靶向玉米淀粉合成途径中的两个关键基因：Sh2（调控超甜籽粒性状）和Wx（控制糯性籽粒性状）。为每个基因设计的两个小向导RNA（sgRNA）被整合到CRISPR/Cas9载体中，随后通过农杆菌介导的转化导入玉米。研究人员获得了无Cas9的T3代纯合sh2和wx突变体株系，其籽粒可溶性糖和支链淀粉含量分别显著增加，但主要农艺性状未发生不利变化。利用这些无Cas9的株系，研究人员开发了一种新型甜糯玉米种质，其同一果穗上糯性和甜性籽粒的分离比为3:1。研究结果表明，CRISPR/Cas9介导的Sh2和Wx编辑能够高效创制甜糯玉米种质，且未检测到连锁累赘。该研究方法有助于优化新型玉米种质的分子育种。

研究背景与意义

玉米作为重要的粮食、饲料和工业原料作物，其市场需求持续增长。甜玉米和糯玉米是两种典型的鲜食玉米类型，分别由淀粉合成途径中不同基因的突变导致籽粒中可溶性糖或支链淀粉过度积累而形成。甜糯玉米作为一种能在同一果穗上同时产生甜性和糯性籽粒的特种类型，因其独特口感和丰富营养而具有巨大的商业价值。然而，传统的甜、糯玉米杂交种选育通常通过回交将突变等位基因导入优良自交系，需要6-7个世代的回交与自交，育种周期长，且常伴有连锁累赘对产量的不利影响。CRISPR/Cas9基因组编辑技术能够缩短育种周期、创建纯合遗传背景并减少连锁累赘的负面影响，为作物育种带来了新机遇。为满足对甜糯玉米等特种玉米品种的迫切需求，本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在玉米Sh2和Wx基因中引入靶向突变，旨在快速、高效地开发新的甜糯玉米种质，同时避免连锁累赘的不良影响。该研究对于通过基因组编辑快速创制具有双优性状的特种鲜食玉米品系、建立高效育种模型以及为优质甜糯玉米品种选育提供有价值的种质资源具有重要意义。本论文发表于《Current Issues in Molecular Biology》期刊。

主要关键技术方法

本研究采用了CRISPR/Cas9基因组编辑技术体系。研究人员利用CRISPOR在线工具为Sh2和Wx基因分别筛选并克隆了两个gRNA靶点序列至pBUE411载体。通过农杆菌介导法，将构建好的载体分别转化玉米自交系C01（靶向Sh2）和B104（靶向Wx）。通过连续自交和筛选，获得无Cas9的T₃代纯合突变体株系。对突变体进行了分子鉴定（PCR及测序）、农艺性状调查、籽粒可溶性糖含量（蒽酮比色法）和支链淀粉含量测定，并利用碘-碘化钾溶液对籽粒胚乳进行染色观察。

研究结果

3.1. gRNA靶点克隆与Sh2-、Wx-编辑玉米株系的创制

研究人员成功构建了靶向Sh2和Wx的CRISPR/Cas9基因编辑载体，并转化玉米，通过PCR筛选确认获得了6株Sh2编辑和5株Wx编辑的T₀代转化植株。

3.2. T₁代株系编辑位点的鉴定

对T₁代纯合基因编辑株系进行测序分析，发现6个sh2T₁株系在靶点1和靶点2分别存在4种和6种不同的突变类型（包括插入、缺失和替换）；5个wxT₁株系在靶点1和靶点2分别存在5种和3种不同的突变类型，部分缺失片段长达349 bp。所有突变位点均位于靶点NGG PAM上游3 bp处。

3.3. 无Cas9 T₃代纯合Sh2编辑突变体株系的表型分析

获得的两个无Cas9 T₃代纯合Sh2编辑突变体株系（sh2-c1和sh2-c2）均产生由167个氨基酸组成的截短蛋白。与野生型（WT）相比，突变体成熟籽粒皱缩、半透明、顶端凹陷，纵向切片显示胚乳因淀粉积累不足而存在空隙。授粉后20天（DAP）测定显示，突变体籽粒可溶性糖含量显著高于WT。同时，两种突变体在株高、穗位高等10个主要农艺性状上与WT无显著差异。结果表明，sh2突变主要影响玉米籽粒糖含量，未对其他农艺性状产生显著影响。

3.4. 无Cas9 T₃代纯合Wx编辑突变体株系的表型评价

获得的两个无Cas9 T₃代纯合Wx编辑突变体株系（wx-c1和wx-c2）均产生由163个氨基酸组成的截短蛋白。突变体成熟籽粒顶端凸起，外观暗淡无光泽。在灯箱下观察，突变体籽粒透光率显著低于WT。授粉后20天测定显示，突变体籽粒支链淀粉含量显著高于WT。碘-碘化钾染色显示，突变体籽粒胚乳呈浅棕褐色（支链淀粉典型显色），而WT胚乳呈深蓝色。与Sh2编辑株系类似，这两种Wx编辑株系在10个主要农艺性状上也与WT无显著差异。结果表明，突变Wx可显著增加玉米籽粒胚乳支链淀粉含量，且不显著改变关键农艺性状。

3.5. 新型甜糯玉米种质的创制

将无Cas9纯合Sh2和Wx编辑株系杂交、自交，选育出基因型为sh2sh2wxwx的P1亲本和基因型为SH2SH2wxwx的P2亲本。杂交P1和P2获得的F₁代（SH2sh2wxwx）自交后，产生了甜糯复合果穗（SW1和SW2），其上糯性籽粒与甜性籽粒的分离比为3:1。表型分析表明，甜性籽粒皱缩、较小，纵向切片显示胚乳淀粉填充不足、严重收缩。生化分析证实，SW果穗上甜性籽粒的可溶性糖含量以及糯性籽粒的支链淀粉含量均显著高于WT。这证实成功创制了一种新型甜糯玉米种质。

讨论与结论总结

甜玉米和糯玉米是重要的特种玉米类型，结合了甜玉米的甜味和糯玉米的软糯质地的甜糯玉米品种市场需求稳步增长。然而，当前大多数栽培品种来源于数十年前的少数自然突变体，传统育种方法受育种周期长、连锁累赘严重、目标性状分离效率低以及基因间上位效应干扰等技术瓶颈限制。本研究中，研究人员利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统靶向编辑玉米Sh2和Wx基因，获得了无Cas9的纯合突变体。sh2突变体成熟籽粒具有典型的皱缩表型，胚乳淀粉含量不足，授粉后20天可溶性糖含量显著增加，且10个主要农艺性状与WT对照无显著差异，表明Sh2的靶向编辑特异性地调控了玉米籽粒糖代谢，未出现显著的多效性或连锁累赘。同样，利用CRISPR/Cas9技术产生的纯合wx突变体产生了糯性籽粒，其他分析的农艺性状也无显著变化，反映了所设计sgRNA的特异性和靶向基因编辑的精准性，获得的种质可用于选育新的糯玉米品种。

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑涉及在靶向基因组区域引入双链断裂，随后通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）途径进行修复。在植物体细胞中，NHEJ是主要修复途径，但常导致插入、缺失和/或替换，从而造成基因敲除。使用两个sgRNA可提高靶基因敲除效率。本研究发现，在6个sh2T₁株系中，靶点2在所有株系中均被编辑，而靶点1仅在5个株系中被编辑。在5个T₁wx突变株系中，靶点1的缺失片段最长可达349 bp。这些基因编辑效率和编辑类型的差异可能与sgRNA设计和靶点可及性的不同有关。使用成对的sgRNA和CRISPR/Cas9系统靶向双位点可能导致两个靶点之间的基因组片段缺失。在本研究检测的sh2和wx突变株系中未检测到这种靶点间的基因组缺失，可能是由于两个设计的靶点之间距离相对较远（分别约为1000 bp和1800 bp）。这表明基因组缺失的效率在很大程度上取决于两个靶点之间片段的长度，短缺失（约100 bp）比较大缺失更容易实现。

综上所述，本研究利用CRISPR/Cas9精确编辑了玉米Sh2和Wx基因，获得的无Cas9纯合甜性和糯性突变体表现出稳定的农艺性状。研究人员还建立了一种高效开发新型甜糯玉米种质的策略，该种质能产生同时含有甜性和糯性籽粒的果穗。在未来的研究中，将该方法与单倍体技术相结合，可能克服传统甜糯玉米育种方法的技术瓶颈，从而无论遗传背景如何，都能高效、精确地编辑Sh2和Wx基因。此外，该策略可能适用于其他作物的遗传改良。

研究结论翻译

总之，在本研究中，利用CRISPR/Cas9对玉米Sh2和Wx基因进行了精确编辑，无Cas9的纯合甜性和糯性突变体表现出稳定的农艺性状。我们还建立了一种高效开发新型甜糯玉米种质的策略，该种质能产生同时含有甜性和糯性籽粒的果穗。在未来的研究中，将我们的方法与单倍体技术相结合，可能克服传统甜糯玉米育种方法的技术瓶颈，从而无论遗传背景如何，都能高效、精确地编辑Sh2和Wx基因。此外，该策略可能适用于其他作物的遗传改良。