一种无需共反应物的电化学发光生物传感器，通过光电子转移和DNA扩增技术实现对谷物中赭曲霉毒素A的微量检测

《Analytica Chimica Acta》：Co-reactant-Free electrochemiluminescence biosensor enabled by photoelectron transfer and DNA amplification for trace detection of ochratoxin A in grains

基于铜纳米簇与功能化金属有机框架复合材料的无共反应物熄灭式电化学发光生物传感器，成功实现了黄曲霉毒素A（OTA）的高灵敏度检测（检测限0.47 pg/mL，线性范围1-100 ng/mL），通过密度泛函理论计算证实其电子转移机制，并整合循环DNA扩增增强信号。

　　

田天|陈敬贵|贾德豪|杜宇|吴婷婷|刘书媛|王珊|杨磊|魏秦

山东省高校界面反应与传感分析重点实验室，济南大学绿色化学制造与精准检测协同创新中心，中国济南250022

摘要：

背景

赭曲霉毒素A（OTA）是一种霉菌毒素污染物，对人类健康构成重大威胁。它是一种常见的天然存在的污染物毒素，在全球的农产品和食品中广泛存在。因此，迫切需要更简单、更灵敏的分析方法来检测食品中的OTA。

结果

在这项研究中，开发了一种无需共反应物的湮灭电化学发光（ECL）生物传感器，用于超灵敏地检测OTA。发射体Ru-Cu NCs@MOFs是通过将铜纳米簇（Cu NCs）锚定到氨基功能化的金属有机框架（NH₂-MOFs）上，然后与Ru(H₂dcbpy)₃²⁺配位而构建的。密度泛函理论（DFT）和Tauc图分析表明，该结构表现出缩小的带隙，促进了界面光电子转移，并有利于激发Ru*-Cu NCs@MOFs物种的生成。这是首次在ECL系统中报道Cu到Ru的电子转移，有效减轻了衰减（ACQ）并显著提高了发光效率。为了进一步提高灵敏度，将循环DNA扩增机制整合到生物传感界面中，从而放大了ECL响应。所得生物传感器的线性范围为1 pg/mL至100 ng/mL，检测限低至0.47 pg/mL。

意义

使用ECL生物传感器检测实际样品中的OTA浓度与酶联免疫吸附测定（ELISA）结果一致，证实了所设计的ECL生物传感器在检测实际样品中OTA的有效性。这项工作提出了一种高灵敏度的ECL传感策略，为食品安全分析中的痕量OTA监测提供了强大的潜力。

引言

赭曲霉毒素A（OTA）是一种在食品和饲料产品中常见的霉菌毒素，由多种真菌产生。作为2B组致癌物，OTA具有显著的免疫抑制和肾毒性作用，对食品安全和公共卫生构成严重威胁[1]、[2]、[3]。尽管已经建立了多种分析方法（如荧光光谱、质谱（MS）和比色测定）来检测OTA[4]、[5]，但由于灵敏度不足、工作流程繁琐以及依赖昂贵的仪器，这些方法的应用仍然有限[6]。这些缺点激发了人们对开发更易获取、快速、灵敏且操作简单的检测方法的兴趣[7]。

电化学发光（ECL）传感作为一种高灵敏度、低背景的分析技术[8]，具有宽线性范围和优异的适用性，这一点在其最近在食品污染物检测中的应用中得到了验证[9]、[10]、[11]。发光材料的性能对于实现ECL生物传感器的高稳定性和灵敏度至关重要。在可用的发光体中，Ru(H₂dcbpy)₃²⁺及其衍生物因其良好的电化学特性和良好的水溶性而特别吸引人[12]、[13]。然而，它们在水介质中的发光常常受到聚集引起的衰减（ACQ）的影响，这主要是由于芳香配体之间的π-π堆叠相互作用[14]。为了解决这个问题，已经使用基于二氧化硅的材料、碳纳米结构和MOFs等纳米载体系统来空间分离发光体，从而改善ECL响应[15]、[16]、[18]。同时，经常引入三丙胺（TPrA）、聚乙烯亚胺（PEI）和氮化硼量子点等共反应物来提高发射效率[19]、[20]、[21]。然而，这些试剂的添加可能导致细胞毒性效应、信号不稳定或能量传递效率不佳等问题，限制了它们在生物传感器开发中的实际应用[22]、[23]。这些限制推动了开发无需共反应物的ECL系统，以实现内在信号增强[24]、[25]。

在这项工作中，我们构建了一种用于检测食品中OTA的新型ECL生物传感器（图1）。首先，我们将铜纳米簇（Cu NCs）与氨基功能化的MOFs（NH₂-MOFs）结合，然后与Ru(H₂dcbpy)₃²⁺配位。NH₂-MOFs不仅作为结构基质固定和稳定Cu NCs，还在调节电子相互作用方面发挥了积极作用，从而促进了向基于Ru的复合物的有效电荷转移。这种配置通过湮灭途径促进了激发态Ru*物种的形成，而无需外加共反应物。支持性研究，包括DFT计算、带隙表征和光学分析，证实了电子导电性的提高以及ECL效率的增强。

由于高灵敏度和低成本，扩增反应已被引入霉菌毒素的分析中。然而，它们对GC富集序列的优先结合限制了它们在多重聚合酶链反应（PCR）中的进一步应用。催化发夹组装（CHA）已成功用于高灵敏度和良好特异性地检测各种核酸；然而，其灵敏度主要取决于分子信标的设计。在这里，我们开发了一种基于循环扩增与发夹探针相结合的高灵敏度和快速检测方法。在该实验中，当OTA结合时，适配体释放出一条互补的DNA（cDNA）链，与DNA模板杂交。聚合酶辅助的链延伸产生了一个含有内切酶Nt.BbvCI识别位点的双链。位点特异性切割使cDNA序列再生，使其能够重新启动循环作为触发器。cDNA的反复生成展开了许多发夹探针，增加了淬灭元素和发光体之间的空间分离，从而增强了ECL信号。探针通过通用触发剂作为引物的催化发夹组装而展开，而不是通过受热力学平衡控制的传统杂交反应。与基于ELISA的分析相比，这种策略结合不需要共反应物的发光体不仅提供了高灵敏度、高特异性和优异的稳定性，还具有宽动态范围和低成本的优势。这为食品安全分析中的OTA监测提供了一种有前景的方法。

试剂

三水合氯化钌（RuCl₃·3H₂O，98%）、2,2'-联异烟酸（H₂dcbpy，95%）、硝酸铬水合物、氢氧化钠（NaOH）、谷氨酸、氯化铜（CuCl₂）、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、亚甲蓝（MB）和6-羟基-1-己硫醇（MCH）购自上海麦克林生化有限公司。盐酸（HCl）和肼（HZ）购自中国医药化学试剂有限公司。OTA由...

Ru-Cu NCs@MOFs的表征

使用透射电子显微镜（TEM）分析了Cu NCs@MOFs的形态和微观结构。活化的NH₂-MOFs表面显示出许多褶皱和多孔结构（图1A）。在NH₂-MOFs表面原位合成Cu NCs后，观察到纳米颗粒的均匀分布（图1B）。此外，高分辨率TEM（HRTEM）成像显示单个Cu NCs的晶格间距为0.209 nm（图1C），对应于Cu的（111）晶面

结论

总之，Cu NCs@MOFs结构是利用含有丰富活性位点的NH₂-MOFs作为Cu NCs的生长基质合成的。当[Ru(H₂dcbpy)₃]?Cl₂与Cu NCs@MOFs结合时，其能带隙显著减小，Ru²⁺的电子云密度得到增强。有效的电子转移通道使得在电化学反应过程中电子从Cu NCs转移到[Ru(H₂dcbpy)₃]?Cl₂，从而实现了更多的...

CRediT作者贡献声明

贾德豪：写作——审阅与编辑，方法学。杜宇：方法学，资金获取，正式分析。吴婷婷：写作——审阅与编辑，监督。刘书媛：写作——审阅与编辑，监督。王珊：方法学，正式分析。杨磊：写作——审阅与编辑，方法学。魏秦：写作——审阅与编辑，监督，项目管理。田天：概念构思，数据管理，写作——初稿。陈敬贵：写作——审阅与编辑，

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号22574062、22574063、22274062）、山东省科技中小企业创新能力提升项目（2025TSGCCZZB0987）、济南大学和研究所创新团队项目（202534040）以及云南省科技计划项目（202405AF140007）的支持。