《Analytica Chimica Acta》：Inception-Level Signal Amplification: Cascaded DNAzyme-Cas9 Nickase Achieves Sub-nanomolar Kanamycin Tracking
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Kanamycin残留快速检测新方法：基于CRISPR-Cas9 nickase（Cas9nAR）与DNAzyme双级放大的荧光生物传感器，通过aptamer开关触发Cas9nAR产生ssDNA模板，自主组装DNAzyme催化荧光信号放大，实现0.3 nM超低检测限和97%-103%高回收率，适用于复杂基质现场检测。
作者：徐文、程宇天、孙凯新、吴月、徐一鸣、叶江、李鹏飞、吴海珍
中国华东科技大学生物技术学院生物反应器工程国家重点实验室，上海
摘要
背景
卡那霉素在农产品中的持续污染对人类健康构成重大风险，因其具有肾毒性和通过食物链的生物累积性。现有的现场卡那霉素监测方法灵敏度和便携性不足，限制了其在实际应用中的效果。因此，迫切需要快速检测技术。本研究旨在开发一种可用于现场的超灵敏卡那霉素残留物筛查平台，以填补这一空白。
结果
我们设计了一种基于DNA酶辅助的Cas9核酸酶扩增反应（Cas9nAR）的荧光生物传感器。卡那霉素的结合会引发适配体的构象变化，从而触发Cas9nAR驱动的级联扩增，持续产生DNA酶。这些DNA酶能够切割报告探针，实现定量检测。该系统具有宽广的线性检测范围（1 nM – 5 μM）和极低的检测限（0.3 nM），优于传统方法。此外，它对干扰抗生素具有高特异性，并在添加样本的水和牛奶中表现出稳定的回收率（97%至103%）。经过预处理后，分析可在120分钟内完成，证明了其在复杂基质中的操作简便性和稳健性。
意义与创新
本研究首次报道了一种用于小分子检测的CRISPR-Cas9核酸酶/DNA酶级联扩增平台，将可编程核酸扩增与催化信号转换相结合。通过使用Cas9nAR生成的单链DNA作为原位模板，该生物传感器实现了超灵敏且均匀的卡那霉素检测，填补了现场抗生素残留物监测的关键空白。其模块化设计为将非核酸识别事件转化为荧光输出提供了通用策略，对食品安全和环境分析中的即时诊断具有广泛意义。
引言
卡那霉素是一种广泛用于兽医领域的氨基糖苷类抗生素，在农业环境中长期存在，并容易进入食物链，即使微量也会对人类健康造成肾毒性和耳毒性风险[1]，[2]。长期接触超过最大残留限（MRLs）的卡那霉素可能导致严重的肾毒性和耳毒性。因此，全球监管机构要求严格监测卡那霉素的含量。传统的检测技术（如表面增强拉曼光谱（SERS）和高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）虽然准确，但存在操作成本高、耗时以及依赖复杂仪器等局限性[3]，[4]。这些限制阻碍了现场实时监测卡那霉素的需求，凸显了便携式、高灵敏度生物传感器的紧迫性。
基于适配体的生物传感器因其高特异性、热稳定性和易于工程化而具有巨大潜力[5]，[6]。自Song等人首次筛选出特异性适配体以来[7]，已开发出多种基于适配体的生物传感器，采用比色[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]和电化学信号[19]、[20]、[21]、[22]等输出方式。近期研究将信号放大策略（如滚环扩增（RCA）、核酸酶辅助复制（NEAR）和CRISPR-Cas系统）整合进来以提高灵敏度[19]，[23]，[24]，[25]，[26]，[27]。近年来，CRISPR相关的Cas9核酸酶（Cas9n）促进了基于Cas9核酸酶的扩增反应（Cas9nAR）的发展，这是一种在恒定温度（37°C）下一步完成的等温DNA扩增技术。Cas9nAR利用Cas9的D10A突变体核酸酶在特定原间隔序列（PAM）位点引入单链切口，无需双链切割。这种切口通过链置换聚合酶延伸，实现指数级模板循环和连续扩增子生成。与传统NEAR相比，Cas9nAR具有更强的序列可编程性，仅需一个PAM位点。例如，Wang等人利用Cas9n引导的引物延伸在侧向流动条上实现了100 CFU/mL的可视化检测[29]，[30]；Zhou等人将Cas9n切割与SDA和PNA探针结合，实现了复杂样本中的特异性扩增[28]。进一步发展的是Hu等人构建的双Cas平台（DTDP），其中Cas9n触发的复制激活Cas12a转切割，能够以超灵敏度检测低至1 CFU/mL的MRSA[31]。然而，这些方法通常将扩增与被动信号输出（如荧光团淬灭或侧向流动）结合，缺乏输出阶段的催化信号放大步骤，导致其检测限往往不足以监测实际样本中的微量抗生素。
为解决这一问题，我们提出了一种新型均匀荧光生物传感器，通过无缝集成适配体开关、Cas9nAR和原位激活的DNA酶10-23（Dz10-23）来实现双级联扩增。在该设计中，卡那霉素的结合会触发启动子的释放，启动Cas9nAR，生成单链DNA扩增子，作为催化活性Dz10-23的自主组装模板。生成的DNA酶随后切割多个RNA连接的荧光底物，在等温条件下产生荧光信号。据我们所知，这项工作是一种新型的CRISPR-Cas9n/DNA酶级联平台，为超灵敏抗生素监测提供了通用方法。
材料与仪器
Tris碱基、氯化钠、醋酸镁、硫酸铵、赖氨酸、精氨酸、氢氧化钠、十二烷基硫酸钠、EDTA、卡那霉素和氯霉素购自Sigma；二硫苏糖醇、氯化钙和过硫酸铵购自VWR；咪唑、甘油、醋酸、氯化锰和乙醇购自Titan（上海，中国）；甘氨酸、IPTG、Acr-Bis（29:1）、TEMED、氨苄西林、5倍加载缓冲液、DNA标记物和质粒提取试剂盒也用于实验。
反应机制与方法建立
本研究提出了一种基于Cas9nAR和Dz10-23的卡那霉素荧光检测方法。检测原理如图1所示：使用卡那霉素适配体作为信号识别剂，借助Cas9n和Klenow（exo-）实现Cas9nAR反应作为信号放大元件，利用Cas9nAR反应生成的Dz10-23作为信号输出元件。反应体系中卡那霉素的存在会引发适配体序列（Kan Apt）与化合物的结合。
结论
我们开发了一种合理设计的均匀生物传感器，将基于适配体的分子开关与CRISPR-Cas9核酸酶（Cas9n）-DNA酶双级联扩增系统相结合，实现了卡那霉素的超灵敏检测。目标结合后，适配体的构象变化会释放启动子，触发Cas9n辅助的复制（Cas9nAR），生成单链DNA产物，作为催化活性10-23的自主组装模板。
作者贡献声明
徐文：撰写初稿、验证、方法设计、数据整理、概念构建。
程宇天：审稿与编辑、撰写初稿。
孙凯新：可视化处理。
吴月：数据分析。
徐一鸣：审稿与编辑。
叶江：资源获取与资金支持。
李鹏飞：撰写与编辑、监督、项目管理、方法设计、数据分析、概念构建。
吴海珍：撰写与编辑、监督、资源协调。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家重点研发计划（2021YFC2100600）和国家自然科学基金（NSFC）（31900059）的支持。
