简单高效的分离细胞外囊泡的棉纤维-注射器固相萃取方法

《Analytica Chimica Acta》：Simple and high-efficiency cotton fiber-in-syringe solid-phase extraction of extracellular vesicles

外泌体富集棉纤维吸附剂开发及结直肠癌早期诊断应用研究，采用硫醇-烯点击共聚制备choline phosphate功能化棉纤维吸附剂，构建注射式固相萃取装置，通过多价配位高效纯化EV并维持生物活性，血浆样本分析鉴定69种上调和18种下调蛋白，其中TLNA、FLNA等与结直肠癌进展相关。

　　

陈梦曦|唐颖颖|姜紫怡|张静|张海阳|魏银茂

苏州大学药学院，中国苏州，215000

摘要

细胞外囊泡（EVs）在临床诊断和预后预测方面具有巨大潜力。然而，从复杂的体液中分离高纯度的EVs是一项具有挑战性的任务。为了解决这一问题，通过硫醇-烯点击聚合反应将2-(异丙基丙烯酰氧)乙基磷酸胆碱（CP–Et）接枝到磺基棉纤维（SCF）表面，制备了一种名为SCF@CP-Et的磷酸胆碱（CP）功能化吸附剂。SCF@CP-Et表现出高效的EV富集能力，这得益于CP基团与EV膜表面的磷脂酰胆碱（PC）之间的多价配位作用；同时，由于其棉纤维丰富的羟基基团和CP-Et的两性离子特性，该吸附剂还具有良好的抗蛋白质吸附性能。此外，这种棉纤维可以方便地组装成棉纤维注射器固相萃取（SPE）装置。该装置在从细胞培养基、血浆和尿液等各种样品中分离EVs时操作简单便捷，且分离出的EVs能够保持其生物活性。利用这些特性，本研究从结直肠癌（CRC）患者和健康志愿者的血浆中分离出EVs，并通过蛋白质组学分析鉴定了69种上调蛋白和18种下调蛋白。其中大多数上调蛋白（如TLNA、FLNA、ITGB3和MYH9）与CRC的进展相关，证明了这种基于碳纤维的SPE方法在疾病早期诊断中的潜在应用价值。

引言

细胞外囊泡（EVs）是一种由脂质双层包裹的纳米囊泡，能够携带核酸、蛋白质、代谢物和脂质等多种物质[1]。大多数哺乳动物细胞都会分泌EVs，它们在细胞间通讯以及疾病的发生、发展和转移过程中起着重要作用[2][3][4]。大量研究表明，EVs中的这些物质可作为诊断和预后标志物[5]。然而，要实现准确的EV分析，必须获得高质量的EVs，因此从复杂体液中分离EVs成为研究热点[6]。

在已报道的分离方法中，基于吸附剂的固相萃取技术表现出良好的分离效果。通常，吸附剂由载体和附着在载体表面的配体组成。目前已开发出多种类型的载体，如磁性纳米颗粒[8][9][10]、金属有机框架（MOFs）[11,12]、纳米片[13]、二氧化硅微球[14][15][16]和单体材料[17,18]。虽然这些载体具有不同的富集特性，但大多数需要多次离心或过滤步骤。此外，合成材料的生物相容性较差，且可能存在吸附杂质蛋白的风险。配体主要分为生物配体和化学配体：生物配体（如抗体[19]、适配体[20]和亲和肽[21]）对EVs具有高选择性，但成本较高；而化学配体（如脂质[10,12]、金属离子[22,23]、壳聚糖寡糖[24]和两性霉素B[26]）则通过疏水作用、金属离子亲和作用或离子交换等方式捕获EVs。然而，按照相同原理，体液中的蛋白质也可能被同时富集，从而降低EVs的纯度。例如，金属离子（Ti⁴⁺或Zr⁴⁺）会吸附磷酸蛋白[27]，而脂质的强疏水链也可能吸附疏水性蛋白。相比之下，磷酸胆碱（CP）作为一种新型配体，已被用于EVs的分离[14,28]，其通过与EV膜表面磷脂酰胆碱（PC）的多价配位作用实现高效吸附。但目前使用的载体（如二氧化硅颗粒[14]和磁珠[28]）操作复杂且生物相容性不佳。因此，开发新的载体并优化载体与配体的组合至关重要。

天然棉纤维具有较大的比表面积、良好的生物相容性和低成本，且易于获取，适合作为生物应用的载体[29]。特别是棉纤维富含羟基和硫醇基团，可通过化学修饰方便地转化为多种选择性吸附剂。本研究通过硫醇-烯点击聚合反应将2-(异丙基丙烯酰氧)乙基磷酸胆碱（CP–Et）直接接枝到棉纤维表面，制备了一种用于EV富集的吸附剂。使用细胞培养基、血浆和尿液样本详细评估了该吸附剂的吸附性能。此外，该吸附剂被装入注射器中，形成了注射器固相萃取（SPE）装置，避免了传统颗粒吸附剂所需的离心或过滤步骤。最终，该方法用于从血浆中提取和分析EVs，验证了其在疾病早期诊断中的潜力。

方法片段

化学品和试剂

磺基棉纤维（SCF）购自山东聚凯。异丙醇（iPr-OH）、甲醇、乙醇和四氢呋喃（THF）购自天津大茂。2-氯-2-氧-1,3,2-二氧磷杂环烷（COP）、2-(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯（DMAEMA）、4-甲氧基酚（MEHQ）和偶氮异丁腈（AIBN）购自上海阿拉丁。Gibco DMEM（高葡萄糖）培养基和青霉素-链霉素（100×）购自武汉普赛尔。醋酸铀酰也用于实验。

SCF@CP-Et的制备与表征

研究表明，聚合物中的CP基团可与细胞膜表面的PC基团形成强多价配位作用[30]。这一原理已成功应用于EVs的富集[14,28]，但载体的功能化方法因材料不同而有所差异。通常需要先使用乙烯基团（C=C）活化载体，然后在引发剂存在下进行表面聚合[14,28]。

结论

本研究通过硫醇-烯点击聚合反应制备了一种两性离子磷酸胆碱功能化的棉纤维吸附剂（SCF@CP-Et），并成功构建了棉纤维注射器（CF-SPE）装置用于EVs的分离，利用“CP-PC”配位作用实现EVs的快速、特异性分离。得益于棉纤维的亲水性和两性离子特性，该吸附剂在EVs提取过程中表现出优异的抗蛋白质吸附性能。

作者贡献声明

陈梦曦：数据整理、实验设计、方法学研究、软件应用、数据可视化、初稿撰写及修订。唐颖颖：数据整理、数据分析、结果验证。姜紫怡：数据整理、数据分析、软件应用。张静：数据分析、结果可视化。张海阳：项目构思、资金筹集、项目管理、资源协调、实验监督。魏银茂：项目构思、资金筹集、方法学研究、项目管理。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢国家自然科学基金（项目编号：22274129、22204114）、苏州大学创新创业本科培养计划、苏州国际脑疾病诊疗联合实验室的支持，以及山西师范大学张静教授在NTA技术方面的协助。