通过高光谱微拉曼光谱成像技术对人类血清中的贝伐单抗进行表征和定量分析

《Analytica Chimica Acta》：Characterization and quantitation of bevacizumab in human blood serum through hyperspectral micro-Raman spectroscopy imaging

本研究开发了一种超光谱微拉曼成像技术用于检测人血血清中的单克隆抗体贝伐珠单抗，通过优化光谱采集和成像参数，结合经典最小二乘法化学计量分析，实现了0.17 ppm的检测限和0.53 ppm的定量限，为生物样本中单抗的快速、环保分析提供了新方法。

　　

米哈伊尔·利库拉斯（Michail Lykouras）|康斯坦丁·D·乔治亚科波洛斯（Constantine D. Georgakopoulos）|奥尔加·E·马克里（Olga E. Makri）|克里斯托斯·G·孔托亚尼斯（Christos G. Kontoyannis）|马尔维娜·G·奥尔库拉（Malvina G. Orkoula）

希腊阿哈伊亚斯地区普拉塔尼（Platani）的化学工程科学研究所，研究与技术基金会-Hellas（ICE-HT/FORTH），邮编GR-26504

摘要

背景

高效液相色谱-质谱（HPLC/MS）和酶联免疫吸附测定（ELISA）是用于识别和定量生物流体中单克隆抗体的成熟技术，具有高准确性、精确度以及较低的检测限（DL）和定量限（QL）。然而，这些方法较为复杂、具有破坏性、成本较高且需要大量溶剂。相比之下，振动技术（如拉曼光谱）提供了无损、环保且经济高效的分析方法，同时仍能保持分析可靠性。本研究旨在开发一种高光谱微拉曼技术，以最低的检测限和定量限识别和定量人血清中的单克隆抗体。

结果

选择贝伐单抗（bevacizumab）作为模型单克隆抗体，评估其通过微拉曼光谱从血清基质中区分出来的能力。优化了光谱采集条件和成像参数（包括映射步长和每张地图的光谱数量），以确保可靠的识别结果。利用经典最小二乘法（CLS）进行定量分析，结合CLS得分和每种分析物在地图中覆盖的表面积来构建校准曲线。所得模型表现出优异的线性，决定系数（R2）在0.01–1.25 ppm的浓度范围内为0.98至0.99。该方法在人血清中对贝伐单抗的检测限为0.17 ppm，定量限为0.53 ppm。

意义

本研究表明，高光谱微拉曼光谱结合化学计量分析能够实现复杂生物基质中单克隆抗体的自动化、环保定量，达到足够低的检测限和定量限。

引言

贝伐单抗是一种人源化单克隆抗体，具有抑制血管生成的作用。其作用机制是阻断血管内皮生长因子A（VEGF-A），后者会触发新血管的形成。因此，阻断VEGF-A的活性可以防止肿瘤生长所需的关键血管的形成。该抗体广泛用于结直肠癌、非小细胞肺癌、转移性乳腺癌、肾细胞癌、多形性胶质母细胞瘤、宫颈肿瘤和输卵管癌的治疗，通常与化疗联合使用。此外，它还被用于治疗某些眼疾（如年龄相关性黄斑变性、慢性弥漫性糖尿病性黄斑水肿和糖尿病性视网膜病变），尽管尚未获得这些适应症的批准。贝伐单抗以25 mg/mL的溶液形式上市，商品名为Avastin?，目前欧盟国家已有九种贝伐单抗生物类似物获得批准并上市。贝伐单抗通过静脉注射给药，剂量通常在1 mg/kg至10 mg/kg之间，初始输注时间为90分钟。其体积分布范围分别为女性患者2.73 L和男性患者3.28 L。贝伐单抗的消除半衰期约为18-20天，消除速率为0.207 L/天，约2.5小时后血清浓度达到最大值17 ppm。文献中也记载了高达100 ppm的浓度水平，这取决于给药方案和采样时间。因此，开发一种能够检测血清中亚ppm水平贝伐单抗的快速灵敏分析方法对于治疗药物监测、药代动力学研究和生物类似物评估具有重要意义。

材料

帕特拉斯大学医学院眼科部门捐赠了一瓶贝伐单抗溶液，品牌名为Avastin?，规格为100 mg/4 mL（罗氏公司，瑞士巴塞尔）。该溶液的辅料包括D-(+)-海藻糖二水合物（99%，Thermo Fisher（Kandel）GmbH，德国坎德尔）、磷酸二氢钠一水合物（Merck KGaA，德国达姆施塔特）、磷酸二氢钠无水物（Merck KGaA，德国达姆施塔特）和聚山梨酯20（Fisher）。

贝伐单抗在Avastin?中的成分

在Avastin?中，除了贝伐单抗（25 mg/mL）外，还含有海藻糖二水合物（60.0 mg/mL）、磷酸二氢钠一水合物（5.8 mg/mL）、磷酸二氢钠无水物（1.2 mg/mL）和聚山梨酯20（0.4 mg/mL）等无生物活性的辅料，而注射用水作为溶剂。

结论

通过高光谱微拉曼成像技术，在优化了拉曼光谱采集参数和成像条件后，成功检测到了人血清中的贝伐单抗，并对其进行了定量。该方法也可用于其他体液中单克隆抗体的检测和定量。所开发的方法具有广泛的应用潜力。

资金来源

本研究未获得公共部门、商业机构或非营利组织的任何特定资助。

作者贡献声明

米哈伊尔·利库拉斯（Michail Lykouras）：数据整理、研究、方法论、软件开发、验证、初稿撰写； 康斯坦丁·D·乔治亚科波洛斯（Constantine D. Georgakopoulos）：方法论； 奥尔加·E·马克里（Olga E. Makri）：方法论； 克里斯托斯·G·孔托亚尼斯（Christos G. Kontoyannis）：研究、初稿撰写； 马尔维娜·G·奥尔库拉（Malvina G. Orkoula）：概念构思、项目管理、监督、可视化、审稿与编辑。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。