利用Homalomena aromatica通过绿色合成方法制备AgNPs，并探索其具有的治疗性抗氧化和抗菌活性

《Green Chemistry Letters and Reviews》：Harnessing Homalomena aromatica for green synthesis of AgNPs and unveiling therapeutic antioxidant and antibacterial activities

　　**摘要**

利用Homalomena aromatica叶片提取物作为还原剂进行银纳米粒子（AgNPs）的绿色合成方法因其在环境友好性和广泛应用（特别是在分子医学领域）而备受关注。本研究合成了AgNPs，并将其命名为HAL-AgNPs，其特征是颜色变化以及430 nm处的UV–VIS吸收峰。FESEM观察结果显示HAL-AgNPs呈球形，尺寸介于22至60 nm之间；TEM观察则显示其具有多种形状，平均尺寸为19.43 nm。XRD确认其具有面心立方晶体结构，晶粒尺寸为26.92 nm。FTIR分析确定了有助于稳定纳米粒子的功能基团。DLS测定其流体动力学直径为92.06 nm，Zeta电位为-27.50 mV。HAL-AgNPs表现出显著的抗菌活性，对革兰氏阳性菌（B. subtilis, S. aureus）和革兰氏阴性菌（E. coli, P. aeruginosa）均有效，最小抑制浓度（MIC）范围为4.375至17.5 μg/mL。此外，HAL-AgNPs还表现出強的体外抗氧化活性，包括清除DPPH、过氧化氢的能力，以及金属螯合作用。这种成本效益高的合成方法制备出稳定且具有生物活性的HAL-AgNPs，有望在分子医学中作为对抗多重耐药细菌的抗菌剂，并作为合成抗氧化剂的替代品。

**图形摘要**

该图展示了基于植物的银纳米粒子合成与测试的示意图、特性列表、四个培养皿图像以及条形图。左侧图示一盆植物，接着是一个标有“植物提取物”的烧瓶，另一个标有“硝酸银”的烧瓶，还有一个更深的烧瓶标有“合成的银纳米粒子”，这些烧瓶由箭头连接，并附有“植物提取物至硝酸银溶液”的文字说明。一个向下指的箭头标注“应用”，指向下方排列成2×2网格的四个圆形培养皿，标题为“抗菌活性”。每个培养皿被划分为带有标签的楔形区域，其中包含应用样本周围的圆形抑制区；标签包括水、植物提取物、硝酸银和其他处理代码。右上方的一个水平箭头标注“特性分析”，指向一个项目列表，包括紫外可见光分光光度计、场发射扫描电子显微镜、能量色散X射线、傅里叶变换红外光谱和Zeta电位。右下方的条形图显示了垂直轴上的微克/毫升浓度（范围100至500）和水平轴上的DPPH清除百分比（范围0至120）。每个浓度组都有三个在图例中标记的条形图，分别对应“基于植物的银纳米粒子”、“丁基化羟基茴香醚”和“抗坏血酸”。所有数据均为近似值。

**关键词**：绿色合成；银纳米粒子；Homalomena aromatica；抗菌活性；分子医学

**1. 引言**

纳米科学是一个令人兴奋的多学科领域，它结合了生物学、化学、物理学和生物工程，用于设计和开发多功能生物活性纳米粒子（参考文献1，参考文献2）。这些纳米粒子的尺寸通常在1到100 nm之间，旨在在原子和分子尺度上定制材料（参考文献3）。这类材料独特的化学、物理和生物特性增强了其在电子、传感器、催化和制药行业的应用，为药物合成的创新方法奠定了基础（参考文献4）。早期纳米技术的开发应用了物理和化学技术来制备银纳米粒子，但这涉及使用有毒和有害的化学物质、高温高压以及昂贵的材料（参考文献5，参考文献6）。因此，这些纳米粒子可能会向环境中释放有害副产品，引发对动物和植物生命直接和间接毒理学影响的担忧（参考文献7，参考文献8）。为了解决这个问题，迫切需要开发通过环保方法制造的清洁、无毒、生物相容且环保的材料（参考文献9）。因此，利用植物、藻类和微生物等生物实体进行绿色合成成为一种有前景的技术，因为它简单、成本低廉且对环境友好（参考文献10）。通过绿色路线制造的纳米粒子消除了对有害化学物质和高能量输入的需求，使其具有环境可持续性（参考文献11）。然而，使用植物材料相比其他生物材料具有更大优势，因为它降低了维护细胞培养的风险和劳动强度，并将反应时间从数天缩短至几小时（参考文献12，参考文献13）。银及其盐类长期以来一直作为强大的抗菌剂，在治疗和预防性医疗保健中表现出较低的毒性。目前，银纳米粒子（AgNPs）因其在其他贵金属纳米粒子中的卓越性能而成为研究的焦点，因其催化性能和良好的导电性以及在抗真菌、抗氧化、抗菌和抗癌等医疗干预中的广泛适用性而被广泛应用（参考文献14–16）。许多研究利用各种植物提取物（如Lantana camara（参考文献12）、Sambucus ebulus（参考文献15）、Citrus aurantifolia（参考文献17）、Amorphophallus paeoniifolius（参考文献18））合成了具有潜在抗菌和抗氧化活性的银纳米粒子。

Homalomena aromatica，俗称Sugandhmantri，是一种属于天南星科的多年生药用草本植物。它因其治疗价值和芳香精油而备受推崇。传统上，它是印度东北部许多社区饮食中的主要成分。该植物的叶子也可作为蔬菜食用，对消化系统疾病非常有益。其叶柄用作咖喱中的香料和调味品，因其宜人的气味。该植物的根茎用于治疗婴儿的普通感冒（参考文献19）。印度东北部的许多部落将这种植物的叶子和根茎制成糊状物，用于治疗关节疼痛、胃部问题、黄疸、胃痛和皮肤感染。整株植物可用于治疗肌肉无力和风湿病（参考文献20）。此外，叶子可以制成酸辣酱，块茎可以煮食（参考文献21）。居住在印度东部山区（包括锡金和阿鲁纳恰尔邦）和不丹的土著人民利用这种植物作为抗抑郁、抗炎、抗菌、镇静和止痛剂（参考文献22）。据我们所知，目前尚无研究描述使用H. aromatica叶片的水提取物作为还原剂和包覆剂来合成银纳米粒子（AgNPs）。因此，本研究首次尝试利用光谱学和显微镜技术从H. aromatica叶片提取物中合成AgNPs，并对其物理特性进行表征。此外，本研究还旨在评估合成纳米粒子的抗菌和抗氧化特性，以探讨其在分子医学中的潜在应用。

**2. 材料与方法**

**2.1 材料**

新鲜的H. aromatica叶片作为生物材料来自印度特里普拉邦Suryamaninagar的特里普拉大学校区，由特里普拉大学植物学系的B.K. Datta教授鉴定。该植物的标本被存放在特里普拉大学植物学系的标本馆中，标本编号为TUH 4346。

分析级的AgNO3（CAS号：7761-88-8）和氯化亚铁（FeCl2）（CAS号：1392476-70-8）购自Sigma Aldrich公司，蒸馏水（dH2O）则来自特里普拉大学的州生物技术中心。Luria–Bertani（LB）培养基（M1245）和LB琼脂（M1151）、2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl（DPPH）（MB263）、过氧化氢（H2O2）、铁氰化钾（K3Fe(CN)6）（GRM1034）、三氯乙酸（GRM6274）、氯化铁（FeCl3）（GRM1379）、Ferrozine（RM1406）和EDTA（GRM1195）均购自印度的Himedia公司。所有玻璃器皿和设备在进行实验前均用双蒸馏水彻底清洗。

**2.2 H. aromatica叶片提取物的制备**

新鲜的H. aromatica叶片经过三轮双蒸馏水清洗以去除灰尘和杂质，然后在室温下空气干燥3小时。随后，将10克切碎的叶片与100毫升蒸馏水混合，在70°C下煮沸30分钟。提取液冷却后，使用Whatman 1号滤纸过滤。最终得到的浅绿色溶液被冷冻并储存在4°C条件下以备后续使用。

**2.3 生物纳米粒子的合成**

HAL-AgNPs的合成方法是逐渐将1 mM的AgNO3溶液以9:1的比例加入到H. aromatica叶片提取物的水溶液中，具体为90毫升1 mM的AgNO3与10毫升H. aromatica叶片提取物。反应混合物随后置于80°C的烤箱中。为防止光反应，装有混合物的试剂瓶用铝箔包裹并放置于暗处，然后进行UV–VIS分析。在AgNPs合成过程中，使用UV–VIS分光光度计观察并记录反应混合物的颜色变化强度。

**2.4 AgNPs粉末的制备**

AgNPs溶液在12000 rpm下离心30分钟，以分离出澄清溶液和固体层。所得沉淀物过滤后重新分散在25毫升去离子水中。接着，该溶液再次离心以获得纯化的AgNPs。随后，纯化后的溶液冷冻干燥48小时，得到AgNPs粉末，并将其储存在密封的小瓶中以备后续使用。

**2.5 合成AgNPs的特性分析**

HAL-AgNPs的绿色合成使用UV-可见光分光光度计（GENESYS? 180）在350–800 nm范围内进行，光程长度为10毫米的石英比色皿。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析用于识别和表征H. aromatica叶片水提取物中促进AgNPs形成和有效稳定的生物分子，FTIR测量范围为600–4000 cm?1。使用场发射扫描电子显微镜（FESEM）和能量色散光谱（EDS）（Sigma 300，Carl Zeiss）检查合成材料的表面形态和元素组成。通过透射电子显微镜（TEM，JEM-100 CX II）观察合成材料的形状、尺寸和结晶度。X射线衍射（XRD）在PANalytical Empyerean Powder XRD仪器上进行，以确定其晶体性质和尺寸。此外，使用颗粒尺寸分析仪（Litesizer 500）分析了纳米粒子的尺寸分布和Zeta电位（ZP）。

**2.6 AgNPs的抗菌活性**

采用绿色方法制备的银纳米粒子的抗菌性能通过琼脂孔扩散法进行评估（参考文献5，参考文献23）。测试的微生物包括革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，MTCC 424）、大肠杆菌（Escherichia coli，MTCC 40）以及革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，MTCC 2398）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，MTCC 6908）。这些菌株来自印度昌迪加尔IMTECH的微生物类型培养收集中心（MTCC）。实验前，将纯培养细菌在LB培养基上继代培养并在37°C下过夜培养。制备LB琼脂平板，倒入25毫升LB琼脂，然后加入20 μL纯细菌培养液（约1 × 10^6 CFU/mL）以形成细菌菌膜。随后，用无菌打孔器在琼脂孔中打孔，每个孔中加入不同浓度的AgNPs（范围25至100 μg/mL）和10 μL 1 mM的AgNO3。在37°C下过夜培养后，观察并测量抑制区。标准抗生素庆大霉素（100 μg/mL）作为阳性对照，蒸馏水作为阴性对照。所有实验均重复三次。抑制区的直径在37°C下过夜培养后确定，并以毫米（mm）表示。

**2.7 最小抑制浓度（MIC）的测定**

评估银纳米粒子（AgNPs）的抗菌活性，使用最小抑制浓度（MIC）来量化其效力（参考文献23，参考文献24）。通过在LB培养基中培养不同浓度的HAL-AgNPs（2.5–50 μg/mL）来确定MIC值。含有1.5毫升LB培养基的无菌Eppendorf管在加入不同浓度的AgNPs后超声处理15分钟以防止纳米粒子聚集。超声处理后，向管中接种新鲜制备的细菌悬浮液（浓度约为1 × 10^6 CFU/mL）。阴性对照为不含AgNPs的LB培养基，阳性对照为含有AgNPs的LB培养基。这些设置在于37°C下振摇培养200 rpm以确保纳米粒子均匀分散并防止聚集。通过测量600 nm处的吸光度来监测细菌生长；吸光度无增加表明MIC。阴性对照（无AgNPs）显示正常细菌生长。所有实验重复三次以确保结果的可靠性和可重复性。

**2.8 HAL-AgNPs的体外抗氧化活性**

抗氧化剂是一类能够抑制其他分子氧化的分子，从而防止活性氧（ROS）和自由基引起的细胞损伤。这些活性物种是细胞代谢的自然副产品，但当过量存在时会导致氧化应激，从而损害蛋白质、脂质和DNA，并促进各种疾病的发展，包括癌症、心血管疾病和神经退行性疾病。使用四种标准方法评估了生物来源的HAL-AgNPs的体外抗氧化活性：DPPH自由基清除试验、过氧化氢清除（H2O2）试验、还原能力试验（RP）和金属螯合试验，这些方法遵循了最近发表的文章（引用25）。这些试验对于筛选和鉴定食品、药品、化妆品及其他生物应用中的潜在抗氧化剂至关重要。

2.8.1 DPPH自由基清除试验
使用标准的2,2-二苯基-1-吡啶基肼（DPPH）试验评估了生物来源的AgNPs的自由基清除活性（引用23、引用25、引用26）。简要来说，将不同浓度的生物来源AgNPs（范围从100到500 μg/mL）和标准抗坏血酸分别放置在试管中。随后，向每个样品中加入0.5 mL新鲜制备的DPPH溶液（0.5 mM），然后剧烈涡旋。之后，将反应试管在黑暗中培养30分钟。培养后，在517 nm处测量吸光度。自由基清除活性通过以下公式确定：(1) DPPH自由基清除活性(%) = [Ac?As] / Ac × 100，其中Ac是对照组的吸光度，As是样品的吸光度以及不同浓度的抗坏血酸的吸光度。

2.8.2 过氧化氢清除（H2O2）试验
使用Ruch等人（引用27）描述的标准方法评估了生物来源AgNPs的过氧化氢清除潜力，该方法被改编用于评估AgNPs清除过氧化氢的效率。在50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中制备了40 mM的过氧化氢溶液。随后，向过氧化氢溶液中加入不同浓度的AgNPs（范围从100到500 μg/mL），然后加入蒸馏水。经过10分钟的培养时间后，将230 nm处的吸光度与不含H2O2的空白磷酸盐缓冲液进行比较。使用以下公式计算过氧化氢的清除百分比：(2) %清除(H2O2) = [Ac?At] / Ac × 100，其中Ac是对照组的吸光度，At是不同浓度下样品的吸光度。

2.8.3 还原能力试验（RP）
使用Oyaizi（引用28）描述的方法评估了还原能力活性。具体来说，将0.5 mL的0.2 M磷酸盐缓冲液（pH 6.6）和0.5 mL的K3Fe(CN)6（1% w/v）与0.2 mL的不同浓度AgNPs溶液（范围从100到500 μg/mL）混合，并溶解在蒸馏水中。在50°C下培养20分钟后，向所得混合物中加入0.5 mL的10% w/v三氯乙酸。以3000 rpm离心10分钟后，收集0.5 mL的上清液，并与0.5 mL蒸馏水和0.1 mL的FeCl3（0.1%, w/v）溶液混合。随后在700 nm处测量吸光度，以空白样品为对照。

2.8.4 金属螯合试验
使用Soler-Rivas等人（引用29）描述的改进方法评估了生物来源AgNPs的金属螯合活性。在该试验中，将0.5 mL的亚铁氯化物溶液（0.2 mM）与不同浓度的生物来源AgNPs（范围从100到500 μg/mL）混合。通过加入0.2 mL的铁氰化物溶液（5 mM）启动反应，然后在室温下培养10分钟，之后在562 nm处测量吸光度。EDTA作为本实验的阳性对照。使用以下公式计算金属螯合活性的百分比：(3) 金属螯合活性百分比 = [Ac?As] / Ac × 100，其中Ac是对照组的吸光度，As是不同浓度下样品的吸光度。

2.9 统计分析
使用MS Excel 2010计算三次数据（n = 3）的平均值±标准偏差。进行了双因素方差分析（ANOVA）以比较每种提取物。应用Tukey的多重比较检验来确定抗氧化活性在各提取物/样本之间的方差（P < 0.05）。所有ANOVA和Tukey多重比较检验都是使用统计软件程序R 3.6.2（R Core Development Team, 2019）进行的。

3. 结果与讨论
通过使用10 mL的H. aromatica叶提取物和90 mL的1 mM硝酸银溶液，在温度控制的热空气中 oven（80°C）中实现了银纳米颗粒的绿色合成。用于AgNPs绿色合成的反应混合物的锥形烧瓶用铝箔包裹，然后放在热空气中 oven中以避免光反应。

3.1 UV–VIS光谱
通过观察AgNO3溶液和H. aromatica叶提取物的反应混合物的颜色变化（从淡黄色变为深棕色），可视化了AgNPs的初始形成（图1）。这种颜色变化表明纳米颗粒的产生。然后使用UV–VIS分光光度计在350–800 nm的波长范围内监测合成的AgNPs的吸收光谱。如UV–VIS分析（图1）所示，H. aromatica叶的水提取物在300–800 nm范围内未检测到吸收。然而，在21小时、24小时和28小时的培养后，UV–VIS分光光度计显示在430 nm处出现明显的表面等离子体共振（SPR）峰，且随着培养时间的延长峰强度逐渐增加，表明纳米颗粒持续形成。观察到的颜色变化归因于纳米颗粒的独特光学性质，特别是SPR现象，其颜色取决于颗粒的大小和形状（引用30）。这一结果与先前关于使用叶提取物合成AgNPs的研究一致（引用31）。银纳米颗粒以其高效的光吸收和散射能力而闻名，这是由于金属纳米颗粒表面的传导电子在特定波长下发生集体振荡所致（引用32）。SPR峰的位置（介于400和450 nm之间）高度依赖于AgNPs的大小（引用33）。表面等离子体带源于传导带中自由电子的相干存在，特别是在小颗粒中（引用34、引用35）。吸收光谱中可见的带状结构是由于颗粒内电子气体的集体激发以及表面电子密度的规律变化（引用36）。根据Mogensen等人的研究（引用37），峰位的变化受颗粒大小、化学环境、表面吸附物质和介电常数的影响（引用37、引用38）。早期报道中SPR峰位于360至455 nm之间，这通常归因于2至100 nm大小的金属纳米颗粒（引用17、引用39）。生物合成的AgNPs的SPR峰位于410至450 nm之间，表明其形状接近球形（引用16）。

图1. 使用H. aromatica叶提取物合成的AgNPs的UV–VIS光谱（插图：a：H. aromatica叶提取物；b：叶提取物与1 mM AgNO3的反应混合物；c：24小时后HAL-AgNPs的合成）。
该图显示了一个折线图及其上方三个小插图。图表在纵轴上以0.0到3.0的间隔表示吸光度，在横轴上以100的间隔表示波长，范围从300到800纳米。四条彩色曲线分别代表0小时、21小时、24小时和28小时的培养时间。0小时的曲线吸光度保持在0.6以下，并随着波长的增加而逐渐下降。21小时、24小时和28小时的曲线从2.0左右的吸光度开始，然后在接近430纳米处达到最大值，之后在800纳米处逐渐降至约0.5的吸光度。21小时的峰高度最低，28小时时最高，表明随着培养时间的延长吸光度逐渐增加。右下角的图例框标识了每个时间及其对应的曲线颜色。右上角的三张标记为a、b和c的照片分别展示了一个装有液体的锥形烧瓶、含有1毫摩尔硝酸银的反应混合物以及24小时后的产物悬浮液。所有数据均为近似值。

3.2 FESEM分析
使用FESEM检查了生物合成的HAL-AgNPs的形态，并确定了颗粒大小。利用ImageJ软件从FESEM图像计算了纳米颗粒的大小。表面形态分析显示，合成的HAL-AgNPs是多分散的，主要为球形，但在某些地方存在聚集现象。这种聚集导致了较大团簇的形成，表面同时存在单个纳米颗粒和聚集体（图2）。纳米颗粒的大小在22到60 nm之间，平均大小为39 nm。

图2. 使用H. aromatica叶提取物合成的HAL-AgNPs的FESEM显微照片。
该图显示了两张使用H. aromatica叶提取物合成的银纳米颗粒的场发射扫描电子显微镜（FESEM）显微照片，标记为HAL AgNPs。左侧显微照片显示了一个相对平滑的基底上散布着许多明亮、大致球形的纳米颗粒。颗粒的大小和间距各异，有些表现为孤立点，有些形成松散的簇或更密集的斑块。较暗的背景中有一些不规则的线条，表明表面具有纹理。左下角的水平刻度尺表示200纳米，仪器设置和采集日期信息印在图像下方的窄条中。右侧显微照片显示了类似表面的更近距离视图，其中可以看到单个明亮的球体以及更清晰的聚集体。纳米颗粒同样表现为多分散的，较小的点与较大的圆形特征混合在一起，有时会聚集成不规则的群体。底部的刻度尺表示100纳米，以及相似的显微镜设置和日期信息。这两张显微照片强调了HAL AgNPs在支撑表面上的分布和形态。

3.3 TEM分析
进行了TEM研究以确定AgNPs的平均大小、形状和详细形态。图3显示了两种不同放大倍率下的HAL-AgNPs的TEM图像。详细显微分析显示HAL-AgNPs呈现出多种形状，包括三角形、准球形、椭圆形、烧瓶形甚至不规则形状。H. aromatica叶提取物中存在多种还原剂可能是导致纳米颗粒大小和形状不同的原因之一（引用15）。TEM图像表明AgNPs分布均匀，颗粒之间存在轻微的物理相互作用。纳米颗粒的大小范围从9到24 nm，平均大小为19.43 nm，与先前的研究结果一致（引用40）。图3中的红色箭头指示的亮圆形斑点表明HAL-AgNPs位于中心，周围是H. aromatica的植物成分。在之前关于Sonchus arvensis叶介导的AgNPs的研究中也观察到了类似的半透明覆盖区域（引用41）。Jagtap和Bapat在从Artocarpus heterophyllus种子提取物合成的AgNPs中也报告了类似的结果，其中植物化学物质如蛋白质和其他生物分子在覆盖和稳定纳米颗粒方面发挥了作用（引用42）。然而，另一项研究也发现了从Justicia adhatoda L.合成的AgNPs的类似现象。

图3. 使用H. aromatica叶提取物合成的HAL-AgNPs的TEM显微照片。
该图显示了两张使用Houttuynia aromatica叶提取物合成的银纳米颗粒的透射电子显微镜（TEM）显微照片。右侧较大的主显微照片标记为i，显示了许多纳米级的颗粒分散在均匀的背景下。颗粒的大小从几乎圆形到细长或不规则形状不等，有些呈现为合并的裂片状。明亮的圆形中心被较暗的外围区域包围，红色箭头指向显示这种明显核心的选定颗粒。一些较暗颗粒内部可见微弱的内部条纹。主显微照片左下角的白色刻度尺标记为20纳米。左上角的较小插图标记为ii，显示了一个包含更多密集分散的小颗粒的更宽广视野。插图中的红色箭头再次突出了那些明亮的中心颗粒。插图中的另一个白色刻度尺标记为50纳米。

3.4 EDX
分析了HAL-AgNPs的元素组成，如图4所示。EDX分析显示在3 keV处有一个明显的发射峰，表明银（Ag）是主要成分，并且这一特性与银纳米颗粒的特征相符，这也与其他已发表的文章结果一致（参考文献12）。此外，还检测到了其他元素，如碳（C）、氮（N）、氧（O）、铝（Al）和氯（Cl）。这些元素出现高强度和低强度峰的原因是由于叶提取物中的生物分子在HAL-AgNPs合成过程中起到了稳定和包覆的作用（图4）。图4显示了使用H. aromatica叶提取物合成的HAL-AgNPs的EDX光谱。该图展示了使用H. aromatica叶提取物合成的HAL AgNPs的能量分散X射线光谱图，并附有元素组成的数值表。纵轴表示强度，范围从0到大约612计数，每隔约68计数有一个刻度；横轴表示X射线能量，范围从0到大约13千电子伏特，每隔约1.3、2.6、3.9、5.2、6.5、7.8、9.1、10.4和11.7千电子伏特有一个刻度。光谱上有一系列用元素符号标记的尖锐和宽泛的峰。在0到大约1.3千电子伏特之间有几个较小的峰，分别标记为碳、氮、氧、氯和银。在1.3和大约2.6千电子伏特附近有两个较高的峰，标记为铝。在大约2.3到3.3千电子伏特之间有一组紧密排列的峰，标记为氯和银，其中银的峰最高。在大约3.5千电子伏特以上的较高能量区域，基线接近零，没有标记的峰。图的右侧是一个表格，列出了各元素的重量百分比：碳6.82%、氮3.66%、氧12.03%、铝19.86%、氯14.43%和银43.20%。所有数据均为近似值。

3.5. FTIR分析
傅里叶红外光谱是一种低成本、简单且非侵入性的技术（参考文献43）。对纳米颗粒进行FTIR分析对于了解其化学组成、表面性质、相互作用和稳定性至关重要。该技术可以识别出在Ag+离子的生物还原以及HAL-AgNPs的有效稳定过程中起重要作用的生物分子（参考文献44、45）。植物化学物质与金属的配位导致纳米颗粒光谱中峰的强度和位置发生变化。这些已识别的功能基团可能与银相互作用，形成一层包覆层，防止纳米颗粒聚集（参考文献46）。这种定性研究依赖于红外光扫描来观察样品的化学键，通常在室温下进行，测量范围为4000–400厘米^-1（参考文献47、48）。图5展示了使用H. aromatica叶提取物合成的HAL-AgNPs的FTIR光谱，表1列出了不同的吸收峰。图5显示了使用H. aromatica叶提取物合成的HALAgNPs的傅里叶变换红外光谱图。横轴标记为波数（以 reciprocal centimeters 为单位），范围从4000到4000，每隔500有一个主要刻度；纵轴标记为透射率（以百分比为单位），范围从0到100，每隔20%有一个主要刻度。图中有一条不规则的曲线，宽窄不同的凹陷部分表示吸收带。底部标记的波数位置分别为3450.78、2924.29、2360.64、1620.18、1447.55、1323.36、1032.62、914.72、783.45和536.66 reciprocal centimeters。每个值都用一个从轴线延伸到光谱的垂直刻度来表示。在波数范围的极端值处，透射率相对较高（超过80%），然后在大约3500到2500 reciprocal centimeters之间逐渐下降，形成一个宽广的低透射率区域，之后再次上升。在大约1700到500 reciprocal centimeters之间有几个较尖锐的低透射率特征，对应于标记的吸收峰。图左上角有一个标题为“Element and Weight percent”的表格，列出了各元素的重量百分比。

3.6. XRD分析
XRD是一种有效的方法，可用于确定纳米颗粒的大小、形状、原子间的层间距（d-spacing）、比表面积以及纳米颗粒的晶体学细节（参考文献67、68）。通过对HAL-AgNPs进行XRD分析，可以鉴定出其相态、取向和晶粒大小。图6显示了Ag-NPs的XRD图谱，其中一些特征衍射峰与结晶银相关。在2θ度处观察到的布拉格峰分别为38、44、64和77，对应于Miller指数（111）、（200）、（220）和（311），确认了合成AgNPs为面心立方（FCC）晶体结构。所得结果与JCPDS（Joint Committee of Powder Diffraction Standards）数据库中的文件04-0783相匹配（参考文献69）。一些未分配的峰可能是由于HAL-AgNPs表面覆盖了氧化银的晶体衍射平面，或者是由于叶提取物中的有机植物化学物质作为包覆剂而未参与反应，因此仅在样品中以极少量存在（参考文献70、71）。这些发现与使用Acacia ehrenbergiana（参考文献70）和Sonchus arvensis L（参考文献41）合成的AgNPs的类似结果一致。此外，根据XRD分析数据，使用Debye-Scherrer公式D=0.9λβcosθ计算了合成AgNPs的晶体尺寸（表2），其中λ表示X射线波长，β表示半高宽（FWHM）的衍射峰，θ表示布拉格反射峰。表2列出了合成AgNPs的晶体尺寸。

3.7. 纳米颗粒的zeta电位
在纳米颗粒的胶体溶液中，zeta电位（ZP）是一个物理参数，表示纳米颗粒与液体之间的电化学平衡。它反映了颗粒的电荷情况，并指示了胶体系统的潜在稳定性。极正或极负的ZP值会产生强烈的排斥力，而相同电荷的颗粒之间的排斥作用可以防止聚集并确保容易重新分散（参考文献73）。ZP值的增加表明系统具有出色的稳定性和更强的排斥力（参考文献74）。最佳ZP值为±30 mV（参考文献75）。ZP值在±10 mV之间的纳米颗粒几乎呈中性，而ZP值超过+30 mV或低于-30 mV的颗粒分别被认为是强阳离子性和强阴离子性的（参考文献76、77）。动态光散射（DLS）测量提供了纳米颗粒的流体动力学直径分布的峰值。多分散指数（PdI）反映了颗粒尺寸分布的宽度以及平均流体动力学直径。本研究中的纳米颗粒流体动力学直径为92.06 nm（图7(a)），HAL-AgNPs的Zeta电位为-27.50 mV（图7(b)）。

3.8. 体外抗氧化活性
银纳米颗粒（AgNPs）因其显著的抗氧化特性而受到关注，这些特性使其在生物医学应用中具有广泛用途。植物性食物中的多酚和黄酮类化合物是强效抗氧化剂，它们可以中和自由基并调节调节抗氧化防御的信号通路。

3.8.1. DPPH清除活性
DPPH（1,1-二苯基-2-吡啶肼）是一种稳定的紫色自由基。当与抗氧化物质相互作用时，其颜色会从紫色变为淡黄色或无色（参考文献79）。这种颜色变化表明DPPH自由基被还原为其非自由基的中性状态，接受了来自银纳米颗粒的电子。通过光度测量吸收强度的降低，可以量化抗氧化剂的清除活性，从而与标准抗氧化剂（如抗坏血酸）进行比较（参考文献79、80）。较高的吸收强度降低表明更强的抗氧化潜力，这对对抗氧化应激和保持细胞健康至关重要。在本实验中，H. aromatica叶提取物介导的银纳米颗粒（HAL-AgNPs）在不同浓度（100-500 μg/mL）下表现出超过93%的清除活性。DPPH清除活性的结果如图8(a)所示。在100、200、300、400和500 μg/mL的浓度下，HAL-AgNPs的清除活性分别为93.28 ± 0.29%、99.72 ± 0.41%、98.57 ± 1.3%、97.8 ± 0.86%和93.83 ± 0.13%。最高的清除活性99.72 ± 0.41%出现在200 μg/mL浓度。在较低浓度下，抗氧化剂可能遇到与DPPH自由基有效结合的最佳条件，从而表现出较高的清除活性。这可能是由于抗氧化剂分子更容易接近自由基或更有效地利用了可用的抗氧化剂分子。在较高浓度下，抗氧化剂可能表现出促氧化效应而非抗氧化效应。这种现象称为“剂量效应”，即低剂量的物质具有有益效果，而高剂量则具有有害效果。在较高浓度下，抗氧化剂可能开始表现出促氧化行为，从而降低了其整体清除活性。HAL-AgNPs的计算半数抑制浓度（IC50）为28.07 ± 0.67 μg/mL。较低的IC50值表示较强的抗氧化清除活性，而较高的IC50值表示较弱的活性。因此，HAL-AgNPs具有很强的清除活性，其次是抗坏血酸（26.22 μg/mL）和BHA（46.63 μg/mL）。图8显示了合成HAL-AgNPs的抗氧化活性：(a) DPPH自由基清除活性；(b) H2O2清除试验；(c) 还原力试验；(d) 金属螯合试验。每个数值代表平均值±标准差（n=3）。如果条柱上的字母相同，则根据Tukey的多重比较测试，在P≤0.05的情况下没有显著差异。

图8展示了四个图表，比较了HAL AgNPs、丁基羟基茴香醚、抗坏血酸和乙二胺四乙酸在不同浓度下的抗氧化试验结果。左上角的图表是DPPH清除百分比与浓度（以微克/毫升计）的关系图，范围从100到500。纵轴从0到120，每20有刻度标记。每个浓度下HAL AgNPs、丁基羟基茴香醚和抗坏血酸都有三条条柱，所有条柱都集中在90%到110%的清除范围内，误差条较小，并在每条柱上方标注有字母。右上角的图表是过氧化氢清除百分比与相同浓度范围的关系图，纵轴同样从0到120，以20为步长。每个浓度下有两条条柱分别表示HAL AgNPs和抗坏血酸；两者清除率都较高，大多在90%到110%之间，变化较小，并有字母标注。左下角的图表是700纳米下的还原力与浓度（以微克/毫升计）的关系图，纵轴从0到1.8，以0.3为步长。抗坏血酸在300 μg/mL时急剧上升达到峰值1.6，然后略有下降，而HAL AgNPs则形成一条从大约0到0.3逐渐上升的曲线。右下角的图表是金属螯合百分比与浓度（以微克/毫升计）的关系图，纵轴从0到120，以20为步长。在每个浓度下，乙二胺四乙酸的条柱较高，清除率从大约25%增加到接近110%，而HAL AgNPs的条柱上升较慢，从大约15%增加到大约55%。所有误差条都很小，字母标注表示统计分组。

3.8.2 过氧化氢（H2O2）清除试验
过氧化氢是人体内各种生化反应的副产品，尤其是涉及氧气代谢的反应，其在细胞中的积累会产生自由基，即使在非常小的剂量下也会引起强烈的氧化应激，从而导致细胞严重损伤（参考文献81）。因此，过氧化氢（H2O2）清除试验是一种常用的方法，用于测定各种化合物（包括天然提取物、食品和药物）的抗氧化活性（参考文献82）。作为抗氧化剂的AgNPs可以直接与H2O2反应，或促进其分解为水和氧气。这一过程可以减轻氧化应激和细胞损伤。在240 nm处进行的光谱测量可以检测到H2O2浓度的减少，从而量化抗氧化剂的清除活性。因此，高效的清除剂可以减少氧化负担，这对细胞健康和疾病预防至关重要（参考文献80）。在本研究中，HAL-AgNPs被证明是一种强效的抗氧化剂，在不同浓度下可以清除超过90%的过氧化氢。HAL-AgNPs表现出剂量依赖性的过氧化氢（H2O2）清除活性。清除活性的结果如图8(b)所示。HAL-AgNPs的最高清除活性为97.94 ± 1.37%，在500 μg/mL时测定。HAL-AgNPs的计算半数抑制浓度（IC50）为41.1 ± 1.20 μg/mL，表明其具有很强的抗氧化活性。

3.8.3 还原力试验
还原力试验是一种常用的方法，用于评估植物提取物的抗氧化活性。该试验的原理是具有还原潜力的化合物与铁氰化钾（Fe3+）反应生成亚铁氰化钾（Fe2+），后者与氯化铁反应形成铁-亚铁复合物，在700 nm处有吸收峰（参考文献83）。反应混合物的吸光度值增加表示还原力较强。在本研究中，合成的HAL-AgNPs显示出浓度依赖性的吸光度增加，最高吸光度出现在500 μg/mL浓度。然而，在200 μg/mL和400 μg/mL浓度下也记录到了类似的吸光度。然而，不同浓度（100–500 μg/mL）的HAL-AgNPs之间的吸光度差异较小，显示出中等的线性关系（R2 = 0.539），这支持了它们具有中等程度的还原活性。图8(c)展示了不同浓度下HAL-AgNPs的吸光度值在还原力测定模型中的图形表示。

3.8.4 金属螯合试验
金属螯合被认为是一种普遍且有效的抗氧化策略，主要用于重金属中毒的临床治疗。螯合金属的能力至关重要，因为它可以降低催化脂质过氧化的金属浓度（参考文献84, 参考文献85）。螯合剂可以与有毒金属离子结合，形成复杂的结构。通过使用螯合剂铁氰化物（ferrozine）测量游离铁离子（Fe2+）来评估螯合能力。铁氰化物与未结合的Fe2+反应生成Fe2+-铁氰化物复合物，这种复合物在562 nm处有峰值吸光度。加入抗氧化螯合剂后，Fe2+-铁氰化物复合物的数量减少。此外，金属螯合剂还通过降低氧化还原电位和稳定氧化物质而起到辅助抗氧化作用（参考文献84, 参考文献86）。

如图8(d)所示，金属离子螯合活性结果表明HAL-AgNPs可以将铁（Fe3+）还原为亚铁（Fe2+）离子。作为标准的EDTA在500 μg/mL浓度下显示出最高的Fe2+离子螯合活性（98.7 ± 0.02%）。在100 μg/mL浓度下，HAL-AgNPs的螯合活性最低（15.42 ± 0.4%），而在500 μg/mL浓度下增加到45.39 ± 1.13%。本研究观察到HAL-AgNPs的Fe2+离子螯合活性随浓度增加而增强。在100–500 μg/mL的浓度范围内，合成的HAL-AgNPs表现出中等的螯合活性（图8(d)）。作为抗氧化剂，HAL-AgNPs可以螯合Fe2+离子，降低其浓度和反应性，从而使铁等金属离子失活。这些发现表明HAL-AgNPs可以保护细胞免受金属催化的分解反应引起的氧化损伤。

研究表明，使用植物提取物合成的AgNPs通常表现出增强的抗氧化活性，这是由于其中含有植物化学物质，这些物质可以稳定纳米粒子并增强抗氧化效果。AgNPs与这些植物化学物质之间的协同作用放大了整体的抗氧化潜力（参考文献87）。据推测，AgNPs的抗氧化能力归因于植物中的酚类化合物、萜类和黄酮类物质的存在，这些物质使纳米粒子能够作为单线态氧清除剂、氢供体和还原剂发挥作用（参考文献80）。作为抗氧化剂，AgNPs通过多种机制发挥作用：它们可以捐赠电子以中和自由基，并螯合金属离子以防止ROS的形成。此外，AgNPs还可以增强内源性抗氧化酶（如超氧化物歧化酶和过氧化氢酶）的活性，进一步增强细胞对抗脂质、蛋白质和DNA等损害细胞成分的抗氧化防御机制（参考文献52, 参考文献88）。这些纳米粒子具有较高的表面积与体积比，增强了它们与自由基的相互作用。AgNPs减轻氧化应激的能力使它们成为治疗与氧化损伤相关疾病（包括炎症性疾病、神经退行性疾病和癌症）的潜在候选物（参考文献80）。因此，我们假设HAL-AgNPs的抗氧化活性可能与H. aromatica叶片提取物中的抗氧化物质在纳米粒子表面上的主要吸附有关。

3.9 抗菌活性评估
使用H. aromatica叶片合成的生物合成AgNPs（HAL-AGNPs）对所有用于抗菌敏感性测试的细菌菌株均表现出良好的活性。测量并统计了三次重复实验的抑制圈（ZOI）直径（表3）。25–200 μg/mL的浓度范围内出现了明显的抑制圈（图9(a–d)）。在本研究中，不同浓度的HAL-AGNPs（25–200 μg/mL）对所有测试细菌都具有敏感性。革兰氏阳性细菌B. subtilis（图9(a)）和S. aureus（图9(b)）在200 μg/mL HAL-AGNPs浓度下的抑制圈分别为13 ± 1.80 mm和12.33 ± 0.76 mm。相比之下，HAL-AGNPs对革兰氏阴性细菌P. aeruginosa（图9(d)）（15.63 ± 0.78 mm）和E. coli（图9(c)）（14.2 ± 0.8 mm）在200 μg/mL浓度下最为有效。然而，在最低浓度25 μg/mL HAL-AGNPs浓度下，P. aeruginosa的抑制圈最高，为10.7 ± 1.16 mm（图9(d)），其次是B. subtilis（9.33 ± 1.04 mm（图9(a)）。E. coli（9 ± 1.34 mm（图9(c)）和S. aureus（9 ± 1.5 mm（图9(b)）的抑制圈相当。在200 μg/mL浓度下，HAL-AGNPs对所有细菌菌株的抑制作用均较强。HAL-AGNPs的MIC（最低抑制浓度）分别为B. subtilis 17.5 μg/mL、S. aureus 12.5 μg/mL、E. coli 8.75 μg/mL和P. aeruginosa 4.375 μg/mL。P. aeruginosa观察到的极低MIC值突显了HAL-AgNPs的双重功能：纳米粒子的尺寸使其能够有效穿透LPS屏障，而其中的植物化学物质增强了生物相容性，从而持续释放Ag+离子，实现了长期的抗菌效果（参考文献89）。图9显示了使用生物合成HAL AgNPs在25-200 μg/mL浓度下的抗菌活性；(a) B. subtilis；(b) S. aureus；(c) E. coli；(d) P. aeruginosa。

表3显示了HAL-AGNPs对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的抑制圈。
先前发表的一篇文章展示了生物合成AgNPs对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的抗菌活性。Anandalakshmi等人（参考文献90）的研究表明，Pedalium murex叶片介导的AgNPs对E. coli和P. aeruginosa的抑制圈最大，为10.5 mm（15 L/mL），而对Klebsiella pneumoniae的抑制圈最小，为8.5 mm，这与我们的研究结果一致。在本研究中，革兰氏阴性细菌表现出比革兰氏阳性细菌更强的抗菌活性。这种差异可能与细菌细胞壁的结构不同有关。革兰氏阴性细菌的肽聚糖层较薄，外加外膜中的胞外多糖孔隙增强了AgNPs的渗透性，可能赋予其杀菌活性（参考文献91, 参考文献92）。高杀菌活性主要是因为从AgNPs释放出的银阳离子（Ag+）与细菌细胞壁和膜的直接相互作用，这些细胞壁和膜是Ag+杀菌剂的储存库。由于与银阳离子的相互作用，细菌膜结构发生显著变化，导致细菌的膜通透性增加（引用93）。此外，细菌膜中的羧基和磷酸基团使其带有负电荷，而NPs的正电荷使它们能够通过静电作用附着在细菌膜上，从而更容易附着（引用94，引用95）。然而，抗菌活性在不同浓度下的不一致结果可能与AgNPs在琼脂培养基上的扩散和浓度分布有关（引用96）。除了这些机制外，还有各种理论试图解释AgNPs的杀菌机制。尺寸较小的AgNPs（10–50纳米）在生物相容性、稳定性和增强抗菌活性方面更为有效（引用97，引用98）。由于小尺寸的AgNPs具有较高的表面积与体积比，它们与细菌细胞壁接触时会破坏细胞膜，使细胞质内容物泄漏，从而导致细菌死亡（引用95，引用99，引用100）。此外，银纳米粒子的形状和大小、细菌接种量、培养时间以及抗菌活性分析中使用的营养介质等因素都对杀菌活性有影响（引用101）。AgNPs还会与硫醇（?SH）基团相互作用，并在细胞内诱导活性氧（ROS）的产生，从而引起氧化应激（引用102）。自由基的生成会导致DNA损伤、线粒体损伤和细胞壁破坏，这些都是绿色AgNPs抗菌效应的原因（引用103，引用104）。此外，AgNPs还会干扰核糖体的功能，抑制蛋白质合成，并中断参与关键代谢途径（如糖酵解和ATP生成）的酶活性（引用105，引用106）。因此，NPs表现出优异的杀菌性能（引用39）。富含氧的有机/无机纳米材料可作为O2纳米泡和H2O2中间产物的来源，并显著促进细菌失活（引用107）。最低抑菌浓度（MIC）是评估抗菌剂（包括银纳米粒子）效力的关键参数，它表示抑制可见细菌生长所需的最低AgNPs浓度，为了解其对特定细菌菌株的效力提供了重要信息（引用108）。AgNPs达到了良好的MIC值（12.5–25 μg/mL），表明其对所有微生物菌株都具有强大的抗菌作用；这与先前的文献结果一致（引用109，引用110）。已有研究表明，AgNPs对某些革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的抗菌机制。尺寸为5至10纳米的小 AgNPs会破坏枯草芽孢杆菌的细胞膜，降解染色体DNA，导致还原糖泄漏以及细胞内ROS水平升高（引用97，引用111）。AgNPs还作用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细胞壁，导致细胞膜从细胞壁上脱离、DNA浓缩、复制抑制和蛋白质失活。除此之外，AgNPs还会与细胞膜相互作用，破坏细胞膜并导致还原糖泄漏，并与金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌中的含S和P化合物发生反应（引用97，引用112，引用113）。小尺寸的AgNPs（1–10纳米）增加了大肠杆菌的膜通透性，通过细胞成分泄漏和与细胞膜的相互作用干扰了其正常的运输功能。据报道，25纳米的AgNPs会抑制金黄色葡萄球菌的呼吸作用（引用113），而28纳米的AgNPs可以减弱铜绿假单胞菌的群体感应作用（引用114）。最近的一项研究显示，阿卡西亚·埃伦贝吉亚（Acacia ehrenbergiana）植物皮提取物可绿色合成尺寸在1至40纳米之间的AgNPs，这些AgNPs对16种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌具有抗菌活性，其MIC（μg/mL）范围为5至30（引用70）。在不同浓度的AgNPs下，由枣树叶提取物介导合成的AgNPs对革兰氏阳性和革兰氏阴性病原体（包括链球菌和克雷伯菌）显示出出色的抗菌活性，尤其是对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。在25 μg/mL的AgNPs浓度下观察到最大的抑制区，表明抗菌活性具有剂量依赖性（引用115）。总体而言，绿色合成的银纳米颗粒的抗菌机制包括与细菌细胞表面的物理相互作用、诱导ROS产生的氧化应激、遗传物质和蛋白质的损伤、代谢过程的抑制以及生物膜的破坏（见图10）。这些多方面的作用使绿色合成的AgNPs成为多种生物医学和环境应用的理想候选材料，包括抗菌涂层、伤口敷料和水净化系统（见图10）。图10展示了银纳米颗粒作为抗菌剂的可能作用机制。该图示意性地展示了单个细长细菌及其周围被标记的多个效应，这些标记说明了银纳米颗粒和银离子的作用。左侧显示了许多标记为银纳米颗粒和银离子的红点和小十字，它们朝外边界移动并穿过该边界，边界依次标记为黏液层、细胞壁、周质空间和质膜。顶部，包膜中的一个开放孔蛋白被标记为银纳米颗粒的入口点。表面的箭头指示静电相互作用以及银纳米颗粒积累导致的细胞壁或膜损伤，不规则的断裂表示细胞质泄漏和膜孔的形成。在细胞质内部，分散的符号代表氧、氢氧化物和过氧化氢的增加，这些物质通过箭头指向DNA损伤、蛋白质变性（靠近缠结的链）、线粒体功能障碍（靠近卵形细胞器）以及核糖体不稳定（靠近小亚基图标）等区域。右侧，两个长 external appendages 被标记为鞭毛。底部的文字说明了红点代表银纳米颗粒，红十字代表银离子，蓝色圆圈代表羧基，绿色星形代表磷酸基团。

本研究首次成功合成了具有显著抗菌和抗氧化特性的H. aromatica叶介导的AgNPs。所采用的绿色合成方法提供了一种可持续且成本效益高的替代传统方法的方式，无需使用有害化学物质和高能耗。合成的纳米颗粒表现出强大的抗菌活性，对多种细菌菌株都有明显的抑制作用，并通过多种检测方法（包括DPPH、过氧化氢清除、还原能力和金属螯合能力）证实了其强大的抗氧化活性。这些发现突显了HAL-AgNPs在分子医学中的潜力，特别是在对抗多重耐药细菌和作为合成抗氧化剂的天然替代品方面。

4. 结论
本研究采用了一种绿色且环境友好的方法，利用H. aromatica的水提取物作为还原剂和包覆剂来合成AgNPs。通过UV–VIS、FTIR和XRD光谱以及TEM显微镜对HAL-AgNPs进行了表征。进一步分析了HAL-AgNPs的大小和ζ电位，发现所有纳米颗粒均带有负电荷。这些合成的HAL-AgNPs对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均表现出强烈的抗菌活性，并在体外检测中显示出出色的抗氧化活性。因此，从H. aromatica叶提取物中衍生的HAL-AgNPs由于其易于合成、成本效益高、纳米结构稳定以及使用环保材料而具有很大潜力。这项研究首次实现了具有显著抗菌和抗氧化特性的H. aromatica叶介导的AgNPs的合成。生物合成的HAL-AgNPs对多重耐药细菌菌株表现出显著的活性，并在DPPH、过氧化氢清除、还原能力和金属螯合检测中显示出强大的抗氧化能力。FESEM和TEM分析确认了纳米颗粒的不规则但可控的形态，而DLS和ζ电位测量表明其分散性稳定且带有恒定的负电荷。这些特性使HAL-AgNPs适用于制药和其他生物医学应用，特别是在分子医学领域。HAL-AgNPs的成功合成和表征突显了其作为替代抗菌剂和抗氧化剂的潜力，为医学和环境领域的进一步研究和应用奠定了基础。

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