《International Journal of Biological Macromolecules》：Deep eutectic solvent-based extraction of honeybee venom proteins: A green strategy for enhanced recovery and bioactivity
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蜜蜂毒（BV）是富含生物活性肽和酶的复杂混合物，传统提取方法可能破坏其结构。本研究对比了基于胆碱盐（ChCl）的深共晶溶剂（DES）与0.9% NaCl溶液在BV蛋白质提取中的应用，发现urea-based DES系统显著提升melittin等生物活性肽的回收率（达500 nm级颗粒），同时表现出更强的蛋白酶和α-淀粉酶抑制活性。实验证实DES能通过氢键网络稳定蛋白质构象，其提取物生物相容性优于传统方法，为炎症和糖尿病治疗提供新策略。
尼吕费尔·武拉尔（Nilüfer Vural）| 西贝尔·卡亚马克（Sibel Kaymak）
土耳其安卡拉耶尔德勒姆贝亚齐特大学（Ankara Y?ld?r?m Beyazit University）公共卫生研究所，生物治疗产品研究与开发项目（Public Health Institute, Biotherapeutic Products Research and Development Program），安卡拉，土耳其
摘要
蜜蜂毒液（bee venom, BV）是一种复杂的生物基质，富含具有显著治疗潜力的生物活性蛋白质和肽类。高效提取和保存这些成分对于提高其生物利用度和功能性应用至关重要。本研究通过比较深共晶溶剂（deep eutectic solvent, DES）体系与水基NaCl溶液（0.9%，w/v）体系，评估了从蜜蜂毒液中回收蛋白质的效果。共评估了五种基于氯化胆碱的DES配方，其中基于尿素的体系表现最为出色，表现出更高的蜂毒肽（melittin）提取率、更高的药理活性，以及粒径达到500纳米的异质分布。除了肽类富集外，DES提取物还显示出对蛋白酶和α-淀粉酶的强抑制作用，表明其在炎症和糖尿病相关疾病治疗中具有潜在应用价值。血液相容性测试进一步表明，与基于NaCl的体系相比，DES提取物作为静脉给药系统更为安全。总体而言，这些发现强调了DES体系在保持生物活性和生物相容性的同时，能够选择性且高效地回收功能性蜜蜂毒液蛋白质。这项工作为基于DES的提取方法提供了证据，证明这是一种多功能且可持续的方法，有助于绿色回收生物活性蜜蜂毒液成分，为未来在制药和营养保健品领域的应用奠定了基础。
引言
随着对可持续、环保且高生物相容性生物工艺的需求不断增长，人们越来越关注能够减少化学废物、有毒溶剂使用以及生物活性分子结构降解的创新提取技术[1]。这种方法为生物治疗原料的有效利用奠定了基础——这些原料通常富含有价值的生物活性化合物，但尚未得到充分开发，尤其是在药物发现和药品开发领域。蜜蜂毒液（BV）是由欧洲蜜蜂（Apis mellifera L.）产生的高度复杂的生物活性物质，自公元前2世纪以来就被传统用于蜂疗[2]。BV由工蜂的毒腺和附属腺分泌并储存在毒液储存库中，在蜂群防御中起着关键作用。从药理学角度来看，BV具有广泛的治疗特性，包括抗癌[3]、抗炎[4]、抗氧化[5]、神经再生[6]和抗菌[7]作用。与其他膜翅目昆虫的毒液类似，BV主要由生物活性肽、酶、蛋白质以及多种低分子量成分组成，其中许多成分是其强大药理活性的来源。BV的主要成分是水，约占其总含量的80%[7]；剩余的干物质包含蜂毒肽（如melittin、apamin、secapin、procamine A和B、adolapin、tertiapin）以及能引发肥大细胞脱颗粒的肽（MCD肽）[8]。
BV还富含酶类成分，其中磷脂酶A2（PLA2）最为丰富，其次是磷脂酶B（PLB）、透明质酸酶、酸性磷酸单酯酶、溶血磷脂酶和α-葡萄糖苷酶[9]。此外，BV还含有组胺、多巴胺和去甲肾上腺素等重要的胺类和神经递质，以及碳水化合物（葡萄糖和果糖）、磷脂、氨基酸和大量矿物质[7]。鉴于BV成分所具有的多种治疗作用，高效提取和保存其生物活性蛋白质和肽类至关重要。然而，传统的提取和纯化方法可能会使这些分子暴露在严苛的化学或物理条件下，导致构象降解和生物功能下降[10]。因此，开发创新、生物相容且环保的提取技术已成为现代生物加工领域的重点。绿色提取策略（如稳定生物分子的介质、低能耗分离方法或深共晶溶剂）通过减少有害废物的产生，同时保持毒液衍生物的结构完整性和药理活性，提供了有前景的替代方案[11]。推进这些可持续方法不仅有助于制药发展，还能确保蜜蜂毒液作为高价值天然资源的长期可用性和安全利用。深共晶溶剂（DES），特别是由生物基和生物相容的氢键受体（hydrogen bond acceptors, HBAs，如氯化胆碱）及氢键供体（hydrogen bond donors, HBDs，如甘油、葡萄糖或乳酸）配制的天然深共晶溶剂（NADES），因其广泛的氢键网络而具有比单一成分更低的熔点[12]。这种结构化的相互作用不仅提供了温和且可调的溶解环境，还有助于稳定蛋白质的构象和天然折叠[12]。与传统有机溶剂和许多离子液体不同，DES具有非挥发性、不可燃性，并且通常表现出低细胞毒性，非常适合制药和食品级应用。此外，将NADES与超声辅助提取（UAE）结合使用，可以为富含生物活性肽的毒液蛋白组分的选择性回收提供有效策略，同时保持其治疗效果[13]。DES基质的稳定能力有助于保留药理学相关的特性，如酶活性、膜相互作用能力和受体结合亲和力——这些都是蜜蜂毒液衍生肽类治疗剂的关键特征。系统评估DES提取毒液蛋白的结构完整性、生物功能性和血液相容性的综合研究对于填补现有知识空白至关重要。这一方法的进步将支持高价值蜂疗产品的规模化生产，从而促进更绿色的生物加工流程和蜜蜂毒液作为生物医学资源的可持续利用。因此，本研究旨在评估DES辅助提取方法分离BV蛋白的效率，并比较DES配方与传统BV提取方法对其体外生物活性的影响。
材料
蜜蜂毒液样本于8月在安卡拉耶尔德勒姆贝亚齐特大学传统与补充医学研究中心的研究蜂箱中采集。蜂毒肽（melittin）、apamin和PLA2（纯度≥95%，分析级）从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）购买；氯化胆碱（ChCl）从Aromel Chemistry（土耳其科尼亚）采购；Coomassie Brilliant Blue G-250、2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl、Troxol、猪胰源α-淀粉酶和牛胰源胰蛋白酶也从相应来源获取。
DES体系的表征
本研究中，使用氯化胆碱（ChCl）作为氢键受体（HBA），而乙醇、丙醇和甘油（醇类）、乳酸（羧酸类）以及尿素（酰胺类）作为氢键供体（HBDs）。测量并评估了直接影响DES体系中蛋白质提取效果的pH值和粘度参数（表1）。各配方的pH值从强酸性（ChCl:LA；pH 1.94）到弱酸性不等。
结论
本研究比较了使用传统盐辅助水体系（SAPS）和深共晶溶剂（DES）体系从蜜蜂毒液中回收蛋白质的效果。0.9%的NaCl溶液通过离子强度效应有效促进了蛋白质的溶解，并作为基准参考。相比之下，基于DES的体系表现出更优的蛋白质回收率，这可能是由于其结构化的溶剂环境和与生物分子的增强相互作用。
CRediT作者贡献声明
尼吕费尔·武拉尔（Nilüfer Vural）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、项目监督、软件使用、资源管理、方法论设计、实验设计、数据分析、概念构建。
西贝尔·卡亚马克（Sibel Kaymak）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、软件使用、方法论设计、实验设计、数据分析。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
