基于HILIC技术的高分辨率质谱方法，用于全面表征透明质酸水凝胶的降解产物

《Journal of Chromatography B》：HILIC-based high-resolution mass spectrometry method for comprehensive characterization of hyaluronic acid hydrogel degradation products

透明质酸水凝胶通过HILIC-HRMS方法揭示了酸水解和酶解两种降解机制，前者快速生成单糖和小寡糖，后者选择性产生偶数寡糖，为生物材料质量控制提供了新方法。

　　

安娜·瓦斯卡（Annija Vaska）|科莉娅·莫雷特（Kolia Moret）|伊万·伊万年科（Ivan Ivanenko）|安娜·鲁比娜（Anna Rubina）|克里斯蒂娜·萨尔马-安卡内（Kristine Salma-Ancane）|克里斯塔普斯·克拉维尼斯（Kristaps Klavins）

拉脱维亚里加技术大学自然科学与技术学院生物材料与生物工程研究所，Paula Valdena街3-k-1号，里加LV-1048

摘要

透明质酸（HA）水凝胶结合了其固有的生物相容性以及通过化学交联获得的可调性质。然而，准确表征水凝胶的降解动力学对于确保临床使用的安全性和可预测性至关重要。本研究提出了一种HILIC-HRMS分析方法，用于检测化学交联透明质酸的降解产物，包括葡萄糖醛酸、N-乙酰葡萄糖胺、透明质酸四糖（HA4）、六糖（HA6）和八糖（HA8）。色谱分离采用BEH Z-HILIC柱，流动相为10 mM甲酸铵缓冲液和水-乙腈混合物，并比较了酸水解和酶消化两种降解方法的效果。该方法表现出高准确性、精确度、线性以及不受甲醇干扰的能力，从而能够可靠地分析透明质酸片段。定性和定量比较分析揭示了两种不同的降解机制：酸水解快速产生单糖和小寡聚体，而透明质酸酶则选择性地生成偶数个寡聚体，这与酶的特异性切割一致。经过验证的HILIC-HRMS方法能够有效分析透明质酸的降解过程，并支持基于透明质酸的生物材料在生物医学应用中的质量控制。

引言

天然未分支的糖胺聚糖（GAGs），如透明质酸（HA），由重复的β-1,4-葡萄糖醛酸和β-1,3-N-乙酰-D-葡萄糖胺单元组成[1]（见图1）。透明质酸在生物医学领域有广泛的应用，特别是在各种疾病模型中作为水凝胶使用——例如骨关节炎、骨骼畸形和心脏修复——同时作为外泌体、间充质干细胞（MSCs）、药物和生长因子的输送系统[2]。水凝胶的生产方法包括物理和化学方法，其中化学交联剂是最常用的方法之一。交联剂可以提高水凝胶的稳定性，控制其降解过程，并改善其机械性能[3]。使用1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）进行交联可以在BDDE的环氧基团和透明质酸的伯醇之间形成醚键，从而延长水凝胶的临床使用时间[4]。1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的结合可以在羧酸基团和透明质酸的羟基之间形成酯键[5]。由于透明质酸水凝胶具有可定制的物理和化学性质、生物相容性以及能够模拟骨组织的细胞外基质（ECM），因此成为有前景的生物材料[6]。了解透明质酸水凝胶的降解产物及其性能对于确保生物材料的稳定性和安全性至关重要。因此，为了预测水凝胶的降解谱型，需要具备可靠的定量分析方法来测定其降解产物[7]。 现有方法在检测和定量透明质酸水凝胶降解产物方面存在局限性。因此，在透明质酸酶存在的情况下，对透明质酸水凝胶降解的分析仍存在空白。核磁共振（NMR）在降解产物分析方面缺乏选择性和精度；然而，DOSY NMR虽然选择性较好，但无法提供绝对浓度值，只能提供降解趋势的近似值[8]。酶联免疫吸附测定（ELISA）方法难以检测低分子量的透明质酸降解产物，如HA四糖（HA4）、HA六糖（HA6）和HA八糖（HA8），因为较小的分子链可检测的环结构较少，导致即使存在这些降解产物也可能信号较弱或无法检测到[9]。相比之下，基于色谱的技术结合先进的检测器可以克服NMR和ELISA的局限性，实现绝对定量、高灵敏度和对降解产物的良好选择性。然而，仍存在一些挑战。高效液相色谱（HPLC）结合紫外-可见光（UV）检测方法具有高特异性，但仍面临消化不完全、复杂混合物分辨率低以及不同链长下检测器响应不一致等问题[10]。反相离子对（RPIP）-HPLC结合质谱（MS）技术在分离和分析透明质酸寡聚体方面显示出潜力，但高聚合度的寡聚体检测仍有限[11]。Volpi等人开发的在线HPLC/电喷雾离子化-质谱（ESI-MS）方法无需预处理或衍生化步骤即可分离和鉴定透明质酸寡聚体，具有出色的分辨率和完整的结构信息，但无法检测低丰度的寡聚体[12]。反相HPLC-MS结合质谱还可以通过水解产物评估透明质酸的细胞毒性[13]。尺寸排阻色谱结合质谱（SEC-MS）可以通过定量酶消化过程中的修饰片段来确定BDDE修饰透明质酸水凝胶的修饰程度[14]。基于已验证的液相色谱高分辨率质谱（LC-HRMS）处理各种生物样本和基质的能力，我们开发并验证了一种专门用于透明质酸水凝胶降解产物分析的LC-HRMS方法[15]。鉴于之前技术的局限性（如NMR、ELISA、SEC-MS和HPLC-UV），本研究旨在建立一种同时分析透明质酸水凝胶酶解和化学降解产物的方法。尽管已有几种基于LC–MS和HILIC的方法用于分析透明质酸寡聚体，但本研究的创新之处在于多个方面。Lv等人[16]使用BEH酰胺HILIC柱分离了HA四糖（HA4）、HA六糖（HA6）和HA八糖（HA8），但该方法未包括单糖（GlcA和GlcNAc）的分析，且仅适用于纯化的透明质酸样品，而非交联水凝胶。?imek等人的综述[17]涵盖了应用于天然透明质酸及其衍生物的色谱和质谱技术，但未涉及化学交联水凝胶系统的降解分析。相比之下，本研究使用了BEH Z-HILIC柱——一种两性固定相，其保留特性与酰胺相柱有根本区别——特别适合处理由EDC/NHS和BDDE交联引起的复杂降解基质。本研究的主要创新点包括：（i）无需衍生化的样品制备，适用于含有复杂交联剂的样品；（ii）在12分钟的分析时间内同时定量单糖和寡聚体；（iii）能够定性检测交联剂特有的降解产物，包括EDC尿素、水解后的BDDE以及多种HA-BDDE结合物，这些物质在纯化透明质酸样品中不存在，在LC–MS水凝胶降解分析中也未被报道。因此，该方法可用于全面表征透明质酸水凝胶的降解过程，并有助于新的生物材料开发和相关生物研究。

化学试剂和材料

高效液相色谱（HPLC）级甲醇、乙腈、甲酸和甲酸铵（纯度≥99.9%）购自德国达姆施塔特的Merck公司，用于制备流动相。水凝胶由来自捷克共和国Dolní Dobrou?的Contipro a.s.公司的透明质酸（HA；分子量1.67 MDa，纯度>95%）合成。采用两种交联反应：（a）N-羟基琥珀酰亚胺（NHS；纯度98%，Merck）

结果与讨论

本研究开发了一种液相色谱-质谱方法，用于分离和检测化学交联水凝胶中的透明质酸降解产物。该方法能够在透明质酸酶解和酸水解过程中测定降解产物的浓度，从而全面表征水凝胶的降解动力学。它为获取水凝胶降解谱型的详细信息提供了有价值的方法

结论

所开发的无需衍生化的HILIC–HRMS方法为在酶解和酸性条件下同时检测化学交联水凝胶中的透明质酸单糖、寡聚体和交联剂相关降解产物提供了强大的平台，且无需复杂的样品制备过程。快速、高分辨率的色谱分离和定性筛选结合定量降解动力学分析，使得直接分析成为可能

作者贡献声明

安娜·瓦斯卡（Annija Vaska）：撰写、审阅与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法验证、实验设计、数据分析、数据管理。科莉娅·莫雷特（Kolia Moret）：实验设计、数据分析。伊万·伊万年科（Ivan Ivanenko）：实验设计。安娜·鲁比娜（Anna Rubina）：撰写、审阅与编辑、方法验证。克里斯蒂娜·萨尔马-安卡内（Kristine Salma-Ancane）：撰写、审阅与编辑、方法验证、资金筹集。克里斯塔普斯·克拉维尼斯（Kristaps Klavins）：撰写、审阅与编辑、实验监督、资金筹集、概念构思。

关于写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

在撰写本文期间，作者使用了Perplexity AI和ChatGPT来改进语法、拼写和语言表达。使用这些工具后，作者对内容进行了必要的审阅和编辑，并对发表文章的内容负全责。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究由拉脱维亚科学委员会资助，项目名称为“通过局部代谢物输送促进骨骼愈合的化学修饰透明质酸水凝胶（MetaGEL），项目编号lzp-2024/1-0366。