《Leukemia》：A transgenic zebrafish leukemia model driven by KMT2A::MLLT3 (MLL-AF9)
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【编辑推荐】本研究针对由KMT2A::MLLT3（MLL-AF9）融合基因驱动的急性白血病（AML/B-ALL）缺乏稳健、可移植动物模型的问题，成功构建了首个在造血干细胞中表达人源MLL-AF9融合癌基因的转基因斑马鱼模型。该模型可稳定传代，重现人类疾病的病理与分子特征，并能进行白血病细胞的连续移植。这为深入研究MLL重排白血病的发病机制、克隆演化及临床前药物筛选提供了强有力的新型脊椎动物平台。
急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia, AML）是一种极具侵袭性且遗传异质性的血液恶性肿瘤，其根源在于造血干细胞中累积的基因突变。在众多致病遗传改变中，由t(9;11)(p22;q23)染色体易位产生的KMT2A::MLLT3（通常称为MLL-AF9）融合基因尤为引人关注。这种融合基因不仅见于儿童和成人的原发性和治疗相关性急性白血病（包括AML和B-ALL），还与不良的无病生存期和总生存期密切相关，因此，开发针对此类白血病的新型疗法迫在眉睫。然而，药物研发离不开能够精准模拟人类疾病的动物模型。尽管斑马鱼因其易于基因编辑、通体透明、发育快速以及能再现人类造血和恶性肿瘤的分子细胞特征等优势，已成为血液疾病研究的重要脊椎动物模型，但此前尚缺乏由单一癌基因驱动且具备可移植性（即白血病细胞能在受体动物中成功定植并致病）的斑马鱼AML模型。这一空白限制了对MLL融合基因白血病生物学特性及治疗策略的深入探索。
为解决上述问题，并建立更完善的研究工具，研究人员开展了一项开创性工作。他们成功构建了两个独立的转基因斑马鱼品系，让人源KMT2A::MLLT3（MA9）融合癌基因在小鼠Runx1 +23增强子/启动子的调控下，于造血干细胞中特异性表达。这项研究的主要成果和深远意义已正式发表于国际权威血液学期刊《Leukemia》。
为达成研究目标，作者运用了多项关键技术。首先，利用转基因技术构建了表达MLL-AF9融合基因的斑马鱼模型（Tg(R:MA9-EGFP)和Tg(R:MA9-mCherry)）。通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）在幼虫和成鱼中验证了融合基因的表达。其次，采用了组织病理学分析和流式细胞术来系统评估患病鱼的病理表型与造血细胞组成变化。第三，通过将患病斑马鱼的肾髓（Whole Kidney Marrow, WKM）细胞或胸腺细胞移植到经亚致死剂量照射的野生型受体鱼体内，评估了白血病细胞的移植和致瘤能力。第四，利用全外显子组测序（Whole-Exome Sequencing, WES）对患病鱼样本进行测序，以寻找伴随的体细胞突变；同时，对分选的造血细胞进行RNA测序（RNA-Seq）及随后的基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA），以揭示疾病的转录组特征和信号通路改变。
研究结果
MA9转基因斑马鱼发生侵袭性白血病
研究人员发现，在转入MLL-AF9（MA9）基因后，斑马鱼在约六月龄时开始表现出明显的疾病表型，包括腹部膨大、鳃部出血、嗜睡和眼部异常。尸检显示患病鱼肾脏肿大苍白、脾脏肿大并伴有白色表面病灶，组织学分析则发现肾、脾、肌肉等外周组织中存在大量白血病细胞浸润。流式细胞术分析进一步揭示了患病鱼肾髓细胞组成发生了深刻改变，包括前体细胞、淋巴样细胞或髓样细胞群的显著扩增。至两岁时，77%的F0代MA9转基因鱼患上白血病，而对照鱼几乎全部存活，这证明了人源KMT2A::MLLT3在斑马鱼造血系统中的表达能够强效诱导白血病。
MA9白血病模型具有可移植性与可传代性
该研究最重要的突破之一是证明了MA9驱动的白血病具有可移植性。将患病F0代鱼的肾髓细胞移植给受体后，绝大多数受体在短时间内（17-48天）发展出白血病，并且可以从原发性受体再次移植给次级受体，成功诱发疾病，这表明白血病细胞具有强大的自我更新和疾病传播能力。此外，从患病F1代鱼荧光阳性的胸腺中分离的细胞同样能够传播疾病。这些结果共同证实，无论是来自肾髓还是胸腺的MA9驱动白血病细胞，都具备连续移植的能力，凸显了该模型的稳健性和功能相关性。
MA9白血病伴随获得性体细胞突变
为了探究KMT2A::MLLT3斑马鱼白血病是否获得了额外的体细胞突变，研究者对患病鱼进行了全外显子组测序。他们在六个白血病样本中鉴定出多个体细胞突变，其中16个影响了已知的人类同源基因。值得注意的是，有五个突变位于先前在人类癌症中报道为体细胞突变的位置，涉及的基因如Stat5、Cyp2j20等，与转录调控、泛素化等关键细胞过程相关。这些反复出现的、与癌症相关的体细胞突变提示，它们可能作为协同驱动因素，共同促进了转基因MA9斑马鱼白血病的发生与进展。
MA9白血病呈现特定的转录组特征
通过对患病斑马鱼造血细胞的RNA测序分析，研究者发现了一批显著差异表达的基因。进一步的基因集富集分析显示，这些差异表达基因在多个信号通路中显著富集，其中最突出的是KRAS、RAF、MEK通路基因的上调，以及P53通路基因的下调。同时，MLL靶基因也呈现显著富集。这些转录组特征与人类MLL重排白血病的某些已知特征相吻合，表明该斑马鱼模型在分子水平上也模拟了人类疾病。
结论与讨论
本研究成功建立了首个由MLL-AF9（KMT2A::MLLT3）单一癌基因驱动、且具备可移植性的斑马鱼急性白血病模型。该模型不仅重现了人类患者中观察到的疾病侵袭性、病理特征（如器官肿大和细胞浸润）以及造血系统的异质性（髓系和淋系表型），而且其白血病细胞能够连续移植，模拟了人类白血病干细胞的自我更新特性。通过基因组学分析，研究者发现该模型白血病中积累的体细胞突变与人类癌症相关基因存在交集，而其转录组特征则显示KRAS/RAF/MEK信号通路上调和P53通路下调，这与MLL融合基因白血病的部分已知机制相符。
这项研究的意义重大。首先，它填补了斑马鱼血液肿瘤研究领域缺少可移植性MLL融合基因白血病模型的空白。其次，该模型为在整体动物水平上深入研究MLL-AF9白血病的发病机制、克隆演化规律以及寻找与之协同的二次打击事件提供了绝佳平台。最后，斑马鱼模型具有繁殖快、成本低、通量高等特点，非常适合进行中等通量的活体药物测试，这对于加速针对MLL重排白血病这一临床难题的新药研发进程具有重要价值。总之，Tg(R:MA9)斑马鱼模型忠实地模拟了人类KMT2A::MLLT3白血病，为剖析保守的白血病发生通路、研究协同突变以及加速药物发现提供了一个多功能、高效且经济的脊椎动物研究工具。
