高速多重DNA-PAINT成像技术扩展序列库解析核内空间组织

《Nature Communications》：High-speed multiplexed DNA-PAINT imaging of nuclear organization using an expanded sequence repertoire

本研究针对DNA-PAINT（DNA-Points Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography）成像中可用高速优化序列有限、限制多重成像目标数量的问题，开发了六种新的速度优化imager序列，将多重成像能力提升至12靶标，并利用Exchange-PAINT协议在4小时内实现12重超分辨成像，定位精度达3–5 nm。通过9重核内靶标成像，结合定量分析流程，揭示了转录抑制后染色质与核斑（nuclear speckles）接触的丧失。该工作显著提升了多重成像的速度与分辨率，为深入绘制核内空间图谱提供了有力工具。

　　

在生命科学领域，我们能否像绘制高精度地图一样，清晰看到细胞内部数十种生物分子在纳米尺度上的精确分布与相互作用？这曾是困扰科学家的难题。尽管超分辨显微技术（如STORM、DNA-PAINT）打破了光学衍射极限，使纳米级观测成为可能，但多重成像——即同时观测多个目标——仍面临巨大挑战。DNA-PAINT技术利用DNA链的瞬时杂交实现超分辨，其多重能力依赖于将不同靶标编码为不同的DNA“对接链”（docking strand）。然而，此前仅有六种经过速度优化的成像序列（imager sequences）被报道，这意味着直接多重成像最多只能区分六个目标。虽然通过次级探针或适配体策略可以实现近乎无限的多重，但这些方法设计复杂、易产生非正交结合，且早期的DNA-PAINT序列杂交动力学较慢，导致每轮成像需耗时数小时，严重限制了其在动态生命过程研究中的应用。因此，扩充高速、正交的成像序列库，在保持高分辨率的同时实现更快、更多重的成像，是推动该技术迈向广泛应用的关键。

本研究发表在《Nature Communications》上，研究人员通过系统性地探索序列空间，遵循核心设计原则（如imager链不含互补核苷酸、可形成串联重复的核心单元），成功筛选并验证了六种新的速度优化imager序列，与已有的六种序列共同构成了一个包含12种序列的库。利用DNA折纸（DNA origami）纳米结构作为测试平台，他们评估了这些序列的正交性、结合动力学（如结合时间、暗时间）和成像性能。在细胞成像方面，他们采用了基于Exchange-PAINT的实验方案，对固定细胞样本进行多重成像。其中，9重核内靶标成像实验使用了经过DNA对接链标记的纳米抗体与相应一抗预孵育的标记策略，以区分同种属来源的不同一抗。成像后的数据处理和分析采用了包括全局皮尔逊相关性分析、配对交叉相关函数（PCCF）分析以及基于同心圆环的空间共定位（DoC）分析在内的定制化Python分析流程。

研究结果

速度优化DNA-PAINT序列的设计原则

研究人员通过探索整个序列空间，筛选出可用于高速DNA-PAINT的正交imager-对接链对。设计遵循两个基本原则：imager链不得包含互补核苷酸；它们必须能形成可串联形成重叠对接链的核心单元。这产生了两个二核苷酸、四个三核苷酸和六个四核苷酸模块，共得到12种序列，其中6种是之前已报道的。使用携带特定对接链的DNA折纸纳米结构测试表明，12种imager中，有10种表现出特异性正交结合，而R1和R2与R9/R10结构之间存在非特异性交叉结合，这提示了在某些多重成像方案中需避免同时使用这些配对。结合动力学分析显示，这些imager的结合时间从几百毫秒到超过一秒不等，暗时间（结合事件间隔）在10²到10³秒量级，为根据不同成像需求选择imager提供了灵活性。

长结合时间imager的独特优势

新提出的imager中有五个（R8–R12）表现出更长的结合时间。与短结合imager相比，长结合imager能在相同成像帧率下产生更多定位点，从而获得更好的定位精度（更高的信噪比）和更快的靶点采样速度。实验对比显示，在低激光功率密度下，长结合imager R8能分辨出20纳米间隔的DNA折纸网格，而短结合imager R1则不能；在高激光功率下，R8也能达到更优的定位精度（σ = 3.79 nm）。此外，长结合imager允许在更低激光功率下成像，有助于减少光损伤。

扩展的序列库适用于细胞成像

为验证新序列在细胞环境中的适用性，研究人员首先用其成像核纤层蛋白Lamin B1，发现除R3 imager在核仁区域有非特异性定位外，其余均表现正常。这表明扩展的序列库可用于细胞水平的高速多重成像。由于R3 imager存在脱靶倾向，在后续多重成像中被排除。

高速多重成像九个核内靶标

研究人员利用扩展的序列库，结合Exchange-PAINT和DNA标记的纳米抗体技术，对九个核内标志物进行了9重超分辨成像。这些靶标涵盖了活性转录常染色质区域（如RNA聚合酶II Ser2磷酸化（RNAPolII-S2P）、Ser5磷酸化（RNAPolII-S5P）、剪接因子SC35、H3K4me3、H3K27ac）、异染色质区域（H3K27me3、H3K9me3、Lamin B1）以及架构转录因子CTCF。成像在约4小时内完成，定位精度优于8纳米，成功揭示了单细胞内核内靶标复杂而差异化的空间分布。

转录抑制导致染色质结构重构

为了探究细胞过程扰动下的核内空间重组，研究人员用转录抑制剂放线菌素D（Actinomycin D, ActD）处理细胞。与对照（Mock）细胞相比，ActD处理导致核斑形态从不规则变为圆形，并且活性染色质标记（H3K27ac, H3K4me3）水平整体降低。全局相关性分析显示，转录抑制后，核斑与所有染色质标记（包括RNA聚合酶标记）之间的正相关性普遍丧失，甚至变为负相关，这表明转录抑制破坏了染色质与核斑之间的RNA介导的锚定作用。与此同时，异染色质标记与核纤层之间的正相关性略有增强。

多层次空间关联分析揭示细微相互作用

仅靠全局相关性分析可能会掩盖局部相互作用。为此，研究人员采用了配对交叉相关函数（PCCF）分析和空间共定位（DoC）分析。PCCF分析证实，在对照细胞中，核斑与四个常染色质标记在局部尺度上存在明显的空间富集（相互吸引），而与异染色质标记及核纤层相互排斥。ActD处理则导致核斑与所有染色质标记的富集关系丧失。DoC分析从每个定位点的角度计算空间相关性，成功再现了异染色质标记与核纤层之间的强正相关。有趣的是，尽管PCCF显示核斑与常染色质标记相互吸引，但DoC分析中后者却显示出与核斑的负相关占比更高。这种表面矛盾可能源于活跃转录的染色质是环绕在核斑外围分布的，导致在核斑定位点周围同心环中，随着距离增加，常染色质标记的密度先增后减，从而在DoC计算中表现为负相关趋势。这恰恰凸显了核斑与常染色质之间是一种外围相互作用的特殊空间模式。

研究结论与意义

本研究成功将高速优化DNA-PAINT成像序列的数量从6个扩展至12个，并系统表征了其正交性和动力学特性。利用该序列库，首次在4小时内实现了对9个核内靶标的多重超分辨成像，定位精度达纳米级。通过结合多重成像与多层次定量分析流程（全局相关、PCCF、DoC），研究人员不仅绘制了基础状态下的核内空间图谱，还精准捕捉到转录抑制导致的染色质与核斑相互作用丢失等纳米尺度的结构重排。这项工作证明，扩展的序列库能显著提升DNA-PAINT的多重成像能力和速度，同时保持高空间分辨率。

其重要意义在于：

1. 1.
   技术推动：为DNA-PAINT领域提供了更丰富的序列工具，直接将高速多重成像能力提升至10-12个靶标，并可与左旋DNA imager等技术结合进一步扩展多重能力。这有助于推动DNA-PAINT在更多细胞成像应用中的普及。
2. 2.
   方法学创新：展示了长结合imager在提高分辨率、降低激光功率需求方面的优势，为不同成像需求提供了更多选择。
3. 3.
   生物学洞察：首次在单细胞、纳米分辨率下同时观察多个核内功能区域的空间组织及其在转录扰动下的动态变化，为理解核内结构与功能关系提供了直接证据。研究揭示的核斑与常染色质“外围相互作用”模式，深化了对核斑功能的理解。
4. 4.
   应用前景：该技术可用于空间蛋白质组学、相互作用组构建，以及对染色质构象、核内相分离等前沿问题的研究，在生物医学基础研究和疾病机制探索中具有广泛潜力。

总之，这项研究通过巧妙的序列工程和严谨的成像分析，突破了多重超分辨成像的瓶颈，为在纳米尺度上解密细胞核内复杂而动态的“分子社会”提供了强大的新工具。