《Journal of Bacteriology》：CRISPRi and beyond: studying essential gene function in the obligate intracellular bacterium Chlamydia trachomatis
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这篇综述聚焦沙眼衣原体（C. trachomatis）必需基因功能研究的最新遗传学工具。沙眼衣原体是导致细菌性性传播感染（STIs）和可预防传染性失明的主要病原体，其精简基因组中超过半数开放阅读框（ORFs）被预测为必需基因。文章系统比较了CRISPR干扰（CRISPRi）、诱导性小RNA（sRNA）、荧光报告等位基因交换诱变（FRAEM）和质粒表达依赖（DOPE）四种条件性基因敲低（KD）或敲除（KO）系统的原理、优缺点与应用，旨在为揭示衣原体独特生物学和发现新治疗靶点提供方法论支持。
引言
沙眼衣原体（C. trachomatis）是一种革兰氏阴性、专性细胞内细菌，是细菌性性传播感染和可预防传染性失明的主要病因。其独特的双相发育周期包括具有感染性但不分裂的原体（EB）和具有复制能力但无感染性的网状体（RB）。该细菌经历了基因组精简，其基因组大小约为100万碱基对，包含约900-1100个开放阅读框（ORFs）。通过泛基因组分析预测，其中约500个基因是必需的，这些基因与翻译、核糖体生物合成、复制、重组和DNA修复等关键细胞过程相关。由于缺乏无细胞培养基，且传统染色体破坏方法会阻断细菌生长和发育周期进程，研究这些必需基因的功能一直充满挑战。本综述旨在总结和对比过去五年中为研究衣原体必需基因而开发的四种系统。
化学和转座子诱变
在2011年之前，由于衣原体的专性细胞内依赖性和双相发育周期，其一直被认为在遗传上难以操作。早期研究采用化学诱变（如使用乙基甲磺酸酯EMS）来创建突变体文库，并通过正向遗传筛选来鉴定与表型相关的基因。例如，通过靶向诱导基因组局部损伤（TILLING）技术，分离出了色氨酸合酶β亚基基因（trpB）的无效突变株。转座子诱变是另一种工具，其中Himar1 mariner系统已被用于沙眼衣原体，旨在通过转座子定向插入位点测序（TraDIS）等技术实现饱和诱变，以区分必需和非必需基因。然而，低转化效率等问题阻碍了饱和突变体库的建立。尽管如此，这些研究为理解衣原体生长和发病机制提供了重要见解，并为采用靶向遗传方法研究必需基因提供了起点。
研究衣原体必需基因的工具
本综述重点介绍了通过条件性基因敲低或敲除技术并辅以靶基因诱导性互补来研究必需基因的最新进展。具体讨论了四种主要系统：成簇规律间隔短回文重复序列干扰（CRISPRi）、使用小RNA（sRNA）的条件性敲低、带有靶基因诱导性互补的荧光报告等位基因交换诱变（FRAEM）以及质粒表达依赖（DOPE）。每种策略都有其优点和缺点，适用于不同的研究场景。
CRISPRi
CRISPRi是首个为衣原体开发的诱导性基因敲低策略。它利用来自金黄色葡萄球菌（S. aureus）的催化失活Cas9（dCas9）或其同源PAM序列及基因特异性引导RNA（gRNA），通过空间位阻抑制RNA聚合酶（RNAP）与启动子区域的结合或阻断其在编码序列上的延伸，从而在特定位点实现转录敲低。最初的单质粒脱水四环素（aTc）诱导型dCas9系统在靶向非必需基因incA时证明了概念可行性。为了减少漏表达和质粒不稳定性，后续研究对系统进行了改进，包括切换质粒骨架、修饰dCas9的核糖体结合位点、在dCas蛋白C末端添加降解子等。此外，还探索了基于Acidaminococcus dCas12的系统，其原型间隔相邻基序（PAM）序列TTTV在衣原体AT富集基因组中更为常见。两种系统均能有效抑制基因表达。
CRISPRi系统可以通过在dCas9或dCas12的3'端转录融合靶基因（GOI）来实现互补，从而满足分子科赫法则。这种策略还能克服靶向操纵子内基因时可能产生的极性效应。例如，在研究ct227操纵子时，通过在ct226敲低质粒上将ct226、ct225或ct224转录融合到dCas12的3'端，可以研究每个基因对宿主蛋白招募的单独贡献。该技术已成功用于证明多种基因在衣原体中的必需性，例如参与蛋白质降解的ClpXP和ClpCP蛋白酶、复制/转录相关的topA、翻译相关的obgE、细胞分裂相关的ftsK和pbp2、代谢相关的ahpC以及信号传导相关的dacA。此外，CRISPRi还能用于敲低RNA编码基因（如tmRNA），并且dCas12系统已展示出同时敲低多个基因的多重化能力。
尽管存在一些潜在问题，如dCas蛋白的随机漏表达（可通过引入依赖茶碱的E核糖开关来缓解）、质粒丢失（可通过使用壮观霉素抗性及改进质粒骨架来解决）以及可能的残余表达，但只要表型可测量、可重复且可互补，敲低效率本身并不影响结论。总体而言，CRISPRi极大地促进了对衣原体基础生物学的理解。
使用小RNA（sRNA）的条件性敲低
Sütterlin课题组在2025年描述了一种通过使用靶向靶基因5'非翻译区（UTR）内核糖体结合位点（RBS）的sRNA来诱导性敲低靶基因产物的方法。该sRNA基于衣原体内源性的CtrR3 sRNA设计。结合sRNA可阻止核糖体招募，从而减少靶mRNA的翻译和蛋白水平。利用该技术，作者成功诱导性敲低了包涵体膜蛋白IncA和主要外膜蛋白（MOMP）的翻译，其中敲低MOMP导致包涵体内RB数量减少且体积增大，感染性子代产量显著下降。IncA敲低则产生了已知的多包涵体表型。
该技术的一个主要优点是能够靶向操纵子内的单个基因。然而，sRNA与mRNA的结合可能通过rho依赖性极性导致转录提前终止，从而影响同一操纵子下游基因的转录水平。另一个主要缺点是该策略严重依赖抗体或质谱分析来测量靶蛋白的敲低效果，而许多衣原体基因的抗体并不可用。此外，与Tet诱导型启动子相关的漏表达问题，以及过表达sRNA可能产生的非特异性效应，都需要在实验设计中通过设置适当的对照（如乱序sRNA）来评估。
荧光报告等位基因交换诱变与靶基因诱导性互补
FRAEM是首个能够在衣原体中通过同源重组等位基因交换来大片段修饰DNA的技术。其核心创新是使用了一个pL2来源的、表达mCherry的“自杀”载体，该载体通过Tet诱导型表达质粒维持蛋白基因pgp6来调控质粒稳定性。移除诱导剂会导致质粒丢失。利用该系统，研究人员能够用包含绿色荧光蛋白（GFP）和β-内酰胺酶的构建体替换靶基因（如trpA），并通过荧光显微镜追踪等位基因交换和质粒丢失。
Cortina等人使用FRAEM删除了推测的必需基因incS。该过程分为四步：首先，设计包含aadA-gfp筛选盒及incS上下游各3 kb侧翼序列的质粒，并转化至野生型衣原体；其次，通过低感染复数（MOI）多次传代，筛选发生单交换整合（质粒插入侧翼区）的菌株；第三步，转化携带可诱导3xFLAG标记incS的互补质粒；最后，在诱导剂存在下继续传代，筛选发生第二次交换（用aadA-gfp替换染色体incS）且丢失mCherry的克隆。获得的ΔincS菌株在移除诱导剂后，EB产量显著降低，并证明IncS在EB向RB的转化及小鼠阴道感染模型中至关重要。
该方法的主要优点是可以创建真正的条件性敲除。然而，整个过程非常耗时，且依赖于两个低频率的重组事件。获得最终菌株后，需要进行全基因组测序验证。其他潜在问题包括：侧翼区域内基因的剂量增加可能对生长有害；互补蛋白在移除诱导剂后可能持续存在数个细胞周期（可通过添加SsrA降解标签解决）；诱导剂浓度需精细滴定；多次传代中质粒可能发生突变导致靶基因组成型表达。
质粒表达依赖
DOPE方法依赖于II型内含子系统（TargeTron）在诱导性表达靶基因的互补质粒存在下，破坏染色体上的靶基因。该方法在概念上类似于FRAEM。移除aTc可耗竭互补基因产物，从而实现条件性敲除。Fan实验室利用此方法靶向了必需转录调控蛋白GrgA。
具体步骤是：首先，构建一个携带Tet诱导型、对TargeTron具有抗性（通过同义突变实现）的grgA等位基因的穿梭载体，并转化至衣原体。然后，将设计好的、靶向染色体grgA位点的TargeTron自杀载体（携带aadA）转化至上述菌株，在壮观霉素筛选下获得染色体grgA被破坏的突变体。实验表明，移除诱导剂后，GrgA缺陷型衣原体表现出RB生长减少、EB产量急剧下降，并导致晚期基因及σ28、σ54、Pgp4靶基因的下调，破坏了中期转录组。值得注意的是，部分子代EB在tetR或tetO中积累了突变，导致即使无诱导剂也存在GrgA的组成型表达，这可能会影响群体水平的研究。
TargeTron系统的插入效率存在差异，且内含子整合效率在插入片段超过2 kb时会下降。与FRAEM类似，互补蛋白可能存在残留、诱导剂浓度需精确控制、质粒可能发生突变。尽管DOPE比FRAEM更快，但仍是一个相对耗时的过程。
结论
能够稳定转化沙眼衣原体质粒的方法的开发，极大地推动了研究进展。衣原体双相发育周期的特性，加上精简基因组可能使大部分基因成为必需基因，使得解析其细胞分裂、分化和发病机制的分子机制极具挑战。本文描述的这些条件性敲低或敲除基因表达方法的最新进展，将极大地助力必需基因的研究。衣原体基因组的小尺寸既是挑战也是机遇，在领域内的共同努力下，开发靶向所有基因的敲低或敲除文库是可行的，这将显著帮助破译衣原体独特的生物学特性。
