基于磁性Fe3O4的糖基转移酶和蔗糖合成酶共固定化技术，用于提升稀有人参皂苷Rh2的生物合成效率

《Biochemical Engineering Journal》：Magnetic Fe3O4-Based Co-Immobilization of Glycosyltransferase and Sucrose Synthase for Enhanced Rare Ginsenoside Rh2 Biosynthesis

高效磁性纳米载体固定化双酶系统促进人参皂苷Rh2生物合成。采用Ni2+螯合壳聚糖包覆Fe3O4纳米粒子实现UGT和SUSy的一步固定化与共表达，载体负载量达116.8 mg/g，催化效率提升至80.7 μg/mL，经10次循环后活性保留50.6%。

　　

闵图|岳俊松|穆罕默德·萨阿德·艾哈迈德|刘晓晨|史怀琪|赵京云|郝海东|王浩倩|李佳毅|朱凌云|吴占胜

西安理工大学环境与化学工程学院，陕西省纺织化学工程助剂重点实验室，陕西省生物资源开发与污染控制工程研究中心，陕西省纺织染料废水处理重点实验室，中国西安710048

摘要

自由酶的分离和再利用效率低下，常常限制了稀有人参皂苷Rh2的生物催化生产。本研究开发了一种基于Ni²⁺螯合壳聚糖包覆的Fe₃O₄纳米颗粒（Fe₃O₄@CN-Ni²⁺）的共固定策略，以缓解这一瓶颈。使用Ni²⁺-NTA一步纯化His标记的糖基转移酶（UGT）和蔗糖合成酶（SUSy），并将其共固定（Fe₃O₄@CN-Ni²⁺@US），从而促进UDP-葡萄糖的再生并进一步转化为Rh2。这种磁性生物催化剂可以快速回收并重复使用。Fe₃O₄@CN-Ni²⁺@US的蛋白质负载量达到了116.8 mg/g，且与自由酶相比，固定化的系统在热稳定性、pH稳定性和储存稳定性方面都有所提升。在最佳条件下，Rh2的浓度达到了80.7 μg/mL。经过10次重复使用后，Fe₃O₄@CN-Ni²⁺@US仍保留了初始活性的50.6%。这种共固定策略降低了底物（UDP-葡萄糖）和纯化的成本，为Rh2的生物制造及其他His标记的生物催化过程提供了一种可扩展的方法。

引言

人参皂苷Rh2是从人参中提取的一种稀有植物化学物质，具有抗癌、抗衰老和治疗等多种生物活性[1]、[2]、[3]。然而，由于其含量极低，大规模提取十分困难，这限制了其在制药、营养保健及相关行业的应用[4]、[5]。目前已经探索了几种Rh2的生产方法，包括化学合成、植物化学提取和生物催化转化[6]、[7]、[8]、[9]。其中，生物转化因其高效性和环境友好性而备受关注。

糖基转移酶（GTs）已成为合成高价值糖苷的强大生物催化剂。然而，自由酶的稳定性低、回收困难以及再利用性差常常增加运营成本[10]、[11]、[12]。最近，人们致力于克服这些挑战。例如，通过酶工程可以提高底物的转化效率。Fan等人[13]对UGT_BL1进行了改造，显著提高了聚达汀的区域选择性。将酶固定到载体上是提高催化稳定性和实现可持续操作的有效方法。然而，传统的固定方法也存在一些缺点。例如，酶在催化过程中容易从载体上脱落，且固定在载体表面的酶容易因环境因素而失活[14]。这些问题增加了固定过程的难度和成本。有效调节材料的孔径和表面性质可以避免这些问题并提高酶活性[15]、[16]。Cui等人[17]用纳米涂层包覆固定的过氧化氢酶，形成了“屏蔽效应”，保护酶免受生物、热和化学溶剂的损害。据报道，如二氧化硅保护的MOF复合材料等先进结构显著提高了酶的耐酸性和可回收性[18]。受这些进展的启发，将工程化的酶固定在合适的载体上已被证明是一种有效的策略，可以高效回收催化剂、降低运营成本、保持酶活性并在工业相关条件下提高耐久性[19]、[20]、[21]。

考虑到进一步简化回收过程和提高回收效率的需求，磁性纳米颗粒的磁性质使得固定化酶的快速磁分离成为可能。具有超顺磁性的四氧化三铁（Fe₃O₄）是一种常用的磁性纳米材料[22]。例如，将壳聚糖-海藻酸盐复合材料与Fe₃O₄纳米颗粒结合，增强了漆酶的共价结合，从而在外部磁吸附下实现固定化酶的快速分离[23]。此外，糖基转移酶的粗酶液在纯化过程中常常因溶剂暴露和环境波动而活性降低。我们之前的研究团队开发了一种含有6个His标签的重组糖基转移酶（UGT），可催化Rh2的生物合成[24]。含有组氨酸标签的UGT的固定化可以准确捕获特定的金属离子（通常是Ni²⁺、Co²⁺等）在载体上。这种载体材料允许一步纯化和固定His标记的UGT。基于这项工作，利用基于磁性镍材料Fe₃O₄/PMG/NTA-Ni²⁺和Fe₃O₄/PDA@MOF[25]一步固定和回收UGT，利用Ni²⁺离子与His标签序列之间的特异性亲和力实现了这一目标。

为了进一步优化酶的负载微环境，广泛采用了用壳聚糖（一种天然的大分子多糖）包覆磁性核心的方法[27]、[28]。壳聚糖丰富的氨基和N-乙酰基可以根据酶的质子化状态与酶发生动态静电或疏水相互作用，这些相互作用有效保护了酶的活性位点[29]、[30]。利用这些独特的保护性质，如三维多孔壳聚糖气凝胶和壳聚糖-海藻酸盐/Fe₃O₄复合材料等先进复合材料在酶固定化方面表现出优异的性能[31]、[32]。

尽管固定的重组UGT可以通过特异性吸附催化Rh2的形成，但该过程需要昂贵的糖供体UDP-葡萄糖（UDPG），这也是高价值产品合成中遇到的问题。将糖基转移酶与蔗糖合成酶耦合可以实现UDPG的原位再生，从而降低成本[33]、[34]、[35]。例如，将Bs-YjiC糖基转移酶与蔗糖合成酶结合在一个反应体系中，成功提高了人参皂苷的生物合成效率[36]。因此，这种双酶耦合系统提高了Rh2的产量，并为UDPG的再生建立了一条绿色可持续的途径。

在本研究中，设计了Fe₃O₄@CN-Ni²⁺，其中镍离子通过化学方法结合到Fe₃O₄磁性颗粒上，实现了重组UGT和蔗糖合成酶的一步纯化和共固定。所得的生物催化剂Fe₃O₄@CN-Ni²⁺@US通过SEM、VSM和XRD进行了表征。优化转化条件后，通过电泳进一步确认了其特定的吸附能力。

化学物质、菌株和试剂

人参皂苷UDP（HPLC纯度98%）来自上海泽业生物技术公司。Protopanaxadiol（PPD）和Rh2（HPLC纯度>98%）来自上海Siddhartha生物技术有限公司。NiCl₂·6H₂O（99%）、壳聚糖、环氧氯丙烷、戊二醛、乙二胺、咪唑和正丁醇来自上海Titan科技有限公司。BL21-GE02773-28是一种由我们研究团队构建的产糖基转移酶的工程菌株。重组菌株pRSF-McSUSy-S31D（产生蔗糖合成酶）

固定条件对酶负载量和活性的影响

添加的酶量、固定时间、固定温度和pH值都是影响酶固定的重要因素。图1a-d展示了这些参数对Fe₃O₄@CN-Ni²⁺的酶负载能力和相应相对活性的影响。如图1a所示，在固定剂量为10 mg的Fe₃O₄@CN-Ni²⁺载体时，Fe₃O₄@CN-Ni²⁺的蛋白质负载能力和相应的固定化酶的催化活性

结论

在本研究中，重组糖基转移酶（UGT）和重组蔗糖合成酶（SUSy）通过特异性吸附成功共固定到改性的Fe₃O₄纳米颗粒上，从而实现了固定而无需进行蛋白质纯化。所得的载体材料Fe₃O₄@CN-Ni²⁺表现出高的酶负载能力，固定的生物催化剂Fe₃O₄@CN-Ni²⁺@US表现出优异的稳定性和可重复使用性。

CRediT作者贡献声明

刘晓晨：撰写 – 审稿与编辑，资源获取。穆罕默德·萨阿德·艾哈迈德：撰写 – 审稿与编辑。岳俊松：数据管理，概念构思。闵图：撰写 – 初稿，方法学，数据管理。吴占胜：监督，资金获取。朱凌云：实验研究。李佳毅：实验研究。郝海东：验证。赵京云：软件支持。史怀琪：数据分析。

利益冲突声明

作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（22008186, 22268045）；陕西省教育厅科研计划项目（23JP056）；陕西省三秦人才特殊支持计划创新团队及陕西省创新能力支持计划（2025RS-CXTD-033）；陕西省高校青年创新团队（2022TD071）；西安纺织与化学添加剂重点实验室绩效评估奖励与补贴项目的支持。