《Bioresource Technology Reports》：In situ assessment of unsaturated fatty acids using Raman spectroscopy in Yarrowia lipolytica
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拉曼光谱技术无需标记和提取即可实时评估活酵母细胞中脂肪酸不饱和度，与传统GC-MS方法结果一致，为生物基产业提供高效监测工具。
Ritam Dadhara|Jiro Karlo|Darshan Chikkanayakanahalli Mukunda|Surya Pratap Singh
印度卡纳塔克邦达尔瓦德市印度理工学院生物科学与生物工程系，邮编580011
摘要
脂质是一类多样且重要的生物分子。它们在维持膜结构、细胞内通讯以及能量储存方面起着关键作用。许多脂质的主要组成部分是脂肪酸，其化学组成直接影响整个脂质池的物理和生物学性质。特别是这些脂肪酸的饱和程度（无论是饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸还是多不饱和脂肪酸）对其在细胞中的作用以及其在各种工业应用中的价值有着重要影响。在脂质组学研究中，标准方法如气相色谱-质谱（GC–MS）、薄层色谱（TLC）和荧光光谱需要先提取或标记脂质，这掩盖了细胞之间的本质差异。本研究采用拉曼光谱作为一种温和、无标记的方法，直接评估活酵母细胞中的脂肪酸饱和度。这种方法无需繁琐的提取步骤或标记过程。通过使用3005 cm?1、1650 cm?1和1445 cm?1处的拉曼光谱强度比值，我们比较了三种不同的Yarrowia lipolytica菌株（NCIM 3472、NCIM 3589和NCIM 3590）。拉曼数据与GC–MS的结果高度吻合，证实了拉曼光谱在实时脂质分析中的可靠性和灵敏度。此外，还利用拉曼成像技术在单个细胞内定位脂质信号，以验证比率测量的基础。这种简单可靠的方法能够快速测量脂质的饱和度，使其成为研究代谢过程以及作为生物基工业中培养期间和之后的在线监测工具的理想选择。
引言
作为一类多样化的生物分子，脂质对许多生物过程至关重要，例如能量储存、膜结构与流动性，以及调节支持不同细胞通讯和维持稳态的信号通路（Agmon和Stockwell，2017；Fahy等人，2011；Harayama和Antonny，2023；Lipowsky，1995；Record等人，2014；Welte和Gould，2017；Wymann和Schneiter，2008）。脂肪酸构成了脂质的结构基础，由于脂肪酸的组成不同，这些脂质分子表现出显著的结构多样性（Burdge和Calder，2015）。脂肪酸分为三种类型：饱和脂肪酸（SFA），含有一个C=C双键；单不饱和脂肪酸（MUFA），含有一个C=C双键；多不饱和脂肪酸（PUFA），含有两个或更多C=C双键（Ratnayake和Galli，2009）。这些脂肪酸的饱和程度极大地影响了脂质的整体流动性、功能及其在细胞系统中的生物学作用（Biermann等人，2021；Brenner和Peluffo，1966；Hagve，1988；Leekumjorn等人，2009；Opara等人，1994）。这使得脂质成为基础脂质组学和工业应用的主要研究对象。由于真菌和藻类具有较高的生长速率以及将碳流导向脂质生物合成的能力，它们被探索为高效的脂质生产工厂（Leong等人，2018；Mahajan等人，2019）。因此，微生物脂质生产的优化已成为一个研究热点，因为它在生物燃料、营养保健品、药品和生物塑料的生产中具有潜在应用价值（Gupta等人，2023；Leong等人，2018；Ratledge，2013）。能够积累超过20%干生物量作为脂质的微生物被称为产油微生物。其中，Yarrowia lipolytica等物种因其高脂质积累能力而被广泛研究并视为模式生物。在营养限制条件下，这种酵母的脂质积累量可超过其干生物量的80%（Beopoulos等人，2009；Papanikolaou和Aggelis，2010；Ratledge，2002）。它们在脂质生产方面的效率使其成为研究和实际应用中的有希望的候选者，包括生物燃料、食品添加剂、化妆品和可降解塑料的生产（Lazar等人，2018；Papanikolaou和Aggelis，2010）。
传统的分析技术（如气相色谱-质谱（GC–MS）、薄层色谱（TLC）和荧光光谱）进行脂质分析需要繁琐的提取过程、标记步骤以及耗时的试剂处理（Fuchs等人，2011；Gerhardtova等人，2024；Pati等人，2016；Sezgin和Schwille，2011）。这些技术被视为脂质组学的金标准，但它们在脂质分析过程中会破坏细胞的自然完整性，从而阻碍了单细胞水平上的实时或原位监测（Gerhardtova等人，2024；Li等人，2014）。通常，这些方法会掩盖微生物群体内部的自然差异。
最近，拉曼光谱作为一种先进的分析工具受到了关注，它克服了传统技术的局限性。拉曼光谱提供了一种非破坏性、快速且无标记的评估方法，尤其是在分析活细胞中的脂质时（Czamara等人，2015；Greig等人，2024）。它通过探测与特定结构变形相关的振动模式提供分子层面的信息。对于脂质而言，这种方法特别有用，因为它可以捕捉到细胞适应不同生长或压力条件时脂质分子振动的变化（Czamara等人，2015；Wu等人，2011a）。该方法的另一个优点是所有数据都可以在细胞的自然代谢状态下获取，无需复杂的样品处理。此外，了解单细胞水平上的脂质滴液异质性在生物学研究中具有重要意义。例如，准确量化脂质滴液的动态可以显著推进我们对代谢疾病的理解，并提高生物燃料的生产效率（Glatz等人，2010；Lippiello等人，1991；Zhu等人，2022）。这类研究对于探索和开发新型营养保健品、化妆品和其他基于脂质的生物产品同样具有价值（Domínguez等人，2021；Pardeike等人，2009；Zubair等人，2021）。
特别是，多项研究验证了拉曼光谱在追踪不同生物系统中细胞内脂质积累和代谢物动态方面的实用性。例如，拉曼微光谱被用于监测Haematococcus pluvialis在CO2驱动培养过程中的脂质和虾青素变化（Li等人，2017）。同样，使用拉曼成像结合多变量曲线解析技术在Euglena gracilis中单细胞水平上观察了蜡酯的发酵过程（Iwasaki等人，2019）。拉曼光谱还应用于时间分辨脂质组学和发酵过程的实时监测（Dzurendova等人，2023；Wieland等人，2021），以及评估工程酵母菌株的脂质生产（Kochan等人，2018）。早期研究也证实了在线拉曼监测在酵母发酵过程中的可行性（Cannizzaro等人，2003；Schalk等人，2019）。
这些研究表明了拉曼光谱在生物过程监测和微生物脂质分析方面的潜力。然而，许多这些方法依赖于多变量建模和复杂的光谱分析。相比之下，本研究专注于开发一种基于特征脂质带的简单比率分析方法，直接评估三种不同活Yarrowia lipolytica菌株中的脂肪酸饱和度。这些菌株根据其脂质组成被分为含有PUFA的菌株、MUFA和SFA平衡的菌株以及富含SFA的菌株（表S1）。通过测量拉曼光谱带（1650/1445和3005/1445 cm?1）的强度比值，本研究旨在验证一种用于单细胞水平快速、实时脂质分析的可靠光谱平台。通过与标准GC–MS数据的对比，我们证明了拉曼光谱是一种可靠的原位工具，可用于定性和半定量评估脂质饱和度。
部分摘要
微生物菌株和培养条件
NCIM 3472、NCIM 3589和NCIM 3590是从浦那的国家工业微生物收藏中心（NCIM）获得的Yarrowia lipolytica菌株。选择这些菌株是因为它们已经使用GC–MS在改良的葡萄糖富集培养基中进行了脂肪酸谱分析（Katre等人，2012a）。根据先前报道的数据，NCIM 3472含有PUFA，NCIM 3589含有大量的MUFA，而NCIM 3590中的MUFA和SFA含量大致相等在最小培养基中的生长情况
所有三种Yarrowia lipolytica菌株（NCIM 3472、NCIM 3589和NCIM 3590）在添加了60 g/L葡萄糖的YNB培养基中的生长情况与标准酵母培养基相当且一致，如图1所示。120小时内的光密度（OD600）测量显示，这些菌株均未出现生长延迟或抑制现象。OD600还表明，所有三种菌株都从指数生长阶段过渡到了稳态阶段结论
本研究展示了基于拉曼光谱的简单可靠的分析技术在评估三种不同Yarrowia lipolytica菌株中提取和活细胞脂质饱和度方面的有效性。该方法的优点在于它仅使用三个光谱带，因此可以快速、无标记地测量脂肪酸饱和度，同时不会损坏样品。这也减少了其他复杂的多变量建模或任何形式分析的需求
CRediT作者贡献声明
Ritam Dadhara：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、软件使用、方法论设计、数据分析、概念构建。Jiro Karlo：初稿撰写、数据可视化、验证、数据分析。Darshan Chikkanayakanahalli Mukunda：审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、数据分析。Surya Pratap Singh：审稿与编辑、验证、项目管理、实验设计、资金支持利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。致谢
本工作是在印度医学研究委员会（ICMR）的研究资助项目编号IIRP-2023-1734的支持下完成的。
