《International Journal of Biological Macromolecules》：Dual-locked probes inhibit off-target circularization: Enhancing specificity in rolling circle transcription for nucleic acid detection
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本研究设计了一种新型无双侧悬臂双锁定探针（ndRC），通过双发夹结构的空间位阻效应有效抑制非特异性环化，结合外切酶纯化和CRISPR/Cas12a系统，构建了双锁定滚动环转录-CRISPR/Cas12a（DL-RCT-Cas12a）检测平台。该系统实现了HPV16 L1基因片段检测灵敏度达40.31 aM，较传统qPCR具有更优的复杂基质耐受性和高浓度靶标区分能力。
Tiao Han|Keyi Long|Wenxi Hu|Meilin Liu|Mingyi Guo|Danqun Huo|Changjun Hou
教育部生物流变科学与技术重点实验室，重庆大学生物工程学院，中国重庆400044
摘要
滚环复制（RCR）在检测低丰度核酸方面具有巨大潜力。然而，其实际应用常常受到非特异性连接的影响，导致背景信号过高和假阳性结果。在此，我们设计了一种新型的双锁定环状模板，称为无双边突出双锁定探针（ndRC）。该探针利用其双发夹结构中的空间位阻效应，形成“双锁定”机制，有效防止非目标分子的环化。通过将这种模板与外切酶纯化和CRISPR/Cas12a模块结合，我们构建了双锁定RCR-CRISPR/Cas12a（DL-RCT-Cas12a）系统。在该系统中，RCR生成含有crRNA重复序列的长RNA转录本，这些转录本激活Cas12a介导的切割反应，从而增强检测信号。该方法的检测限低至40.31 aM，检测范围为100 aM至1 μM。在复杂样本中，该方法对部分HPV16 L1基因序列的检测表现出稳健性能，并且相比qPCR具有更强的高浓度目标区分能力。这项工作提出了一种提高高灵敏度检测特异性的通用策略，改善了低丰度核酸分析的效果。
引言
精确及时地检测核酸生物标志物对于早期疾病诊断和干预至关重要，这是基于证据的临床决策的基础。虽然聚合酶链反应（PCR）和定量PCR（qPCR）等成熟技术具有高扩增效率，但它们对复杂仪器的依赖性和漫长的操作流程限制了其在即时检测中的应用。因此，等温扩增策略成为有前景的替代方案。包括环介导等温扩增（LAMP）[1]、链置换扩增（SDA）[2]、指数扩增反应（EXPAR）[3]和重组酶聚合酶扩增（RPA）[4] [5]在内的方法能够在恒定温度条件下实现高效核酸扩增，具有简化的工作流程、快速的动力学特性和稳健的性能，从而促进了它们的临床应用[6] [7]。
滚环复制（RCR）是一种由环状模板驱动的等温核酸合成机制，包括滚环扩增（RCA）和滚环转录（RCT）[8] [9] [10]。这种独特的机制使RCR能够产生具有高特异性和保真度的长核酸产物，这些产物包含与模板互补的串联重复序列。这些特性使得RCR在核酸目标检测中具有广泛应用价值，巩固了其作为分子诊断核心技术地位。此外，RCR模板的合理设计允许进行功能定制，例如构建适配体、引入功能序列或酶识别位点[11] [12] [13] [14] [15]。这种内在的可编程性将RCR的应用范围扩展到了生物传感和分子诊断等先进领域。
然而，当单独用于核酸检测时，RCR的灵敏度有限，难以可靠地定量低丰度目标[16] [17]。传统检测方法的灵敏度通常仅达到皮摩尔（pM）水平。例如，Fang等人报道了一种基于RCA的检测方法，使用锁探针，对DNA的检测限为8.3 pM [18]。同样，Yao等人开发了一种将RCA与侧向流动条结合的双检测策略，对miRNA-21的检测限为40 pM，对let-7a的检测限为20 pM [19]。为了解决这个问题，人们提出了多种创新策略。一种显著的方法是将RCR与超灵敏信号读出平台结合，包括CRISPR/Cas系统、电化学传感器和表面增强拉曼光谱（SERS）[20] [21] [22] [23] [24]。在CRISPR/Cas家族中，不同变体在核酸检测方面具有各自的优势。I型CRISPR-Cas3是一种I类系统，利用多亚基级联复合体进行目标识别并激活Cas3核酸酶进行连续DNA切割。这种机制提供了高信号增益，并已被成功用于灵敏检测[25] [26]。然而，作为多蛋白复合体，Cas3系统通常针对特定检测格式设计，可能需要定制的反应条件[27]。相比之下，CRISPR-Cas12a是一种单蛋白II类效应器，具有出色的稳定性、高特异性和简单的反应方案，易于适应多种生物传感平台。这些特点使其与各种扩增策略结合使用得到广泛应用[28] [29]。例如，Teng等人建立了一种严格的“扩增加双序列验证”系统，结合锁探针连接和CRISPR/Cas12a进行精确目标识别和特异性扩增子鉴定，实现了0.62 aM的超低检测限[30]。另一种广泛采用的策略是构建多重级联扩增网络，显著提升总信号输出，从而提高低丰度目标的检测能力[31] [32] [33]。例如，Tang等人使用石墨烯-金纳米复合材料和滚环杂交级联扩增技术开发了一种自驱动生物传感器，对miRNA-141的检测限达到25.9 aM [34]。
尽管取得了这些进展，但这些技术在临床应用中仍面临诸多挑战。复杂的级联扩增系统虽然增强了信号，但由于非特异性引物相互作用、酶不稳定或非特异性探针环化（主要源于线性探针的自发分子内折叠、末端互补序列的部分配对以及探针分子间的分子间交叉连接）而引入了较高的背景噪声——在连接酶存在的情况下，即使没有目标也存在探针环化现象，进一步导致背景信号升高和检测特异性降低[35]。此外，包括复杂设计、有限的通用性和材料合成挑战在内的实际限制也限制了这些技术的广泛应用。鉴于这些局限性，专注于结构控制的探针工程成为实现更高特异性的有希望途径。
各种结构元素，如发夹和回文序列，已被纳入探针设计中以施加构象约束，同时利用足柄介导的链置换来提高识别准确性[36] [37]。这些设计策略促进了具有改进特异性的探针的开发，例如具有双茎环结构的哑铃探针。然而，这些传统探针通常仅需要一个茎环进行目标识别和随后的环化，导致特异性不足和非特异性探针激活的风险增加[38] [39] [40] [41]。此外，许多设计仍受分子间交叉连接和与CRISPR等新兴技术兼容性限制。
为了克服这些限制，我们开发了一种新型的无双边突出双锁定探针（ndRC），其识别和环化机制与传统哑铃探针根本不同。与传统哑铃探针（由两个通过短序列连接的茎环组成）不同，ndRC探针在其两个茎环“锁定”区域之间有一个延长的单链DNA间隔区。这种双锁定设计要求目标同时与两个锁定位点结合，才能通过T4 DNA连接酶实现环化，从而提供双层特异性，有效克服了单茎环识别的不足。此外，延长的间隔区提供了一个长且可编辑的序列，适用于多种扩增模板。目标诱导连接后，环化的探针作为RCR的模板，生成含有该间隔区内编码序列串联重复的长RNA转录本。
在这里，我们介绍了一种名为双锁定滚环转录-CRISPR/Cas12a（DL-RCT-Cas12a）的新型级联检测系统，该系统将这种结构锁定的探针与正交信号放大技术结合，实现超灵敏和高特异性的核酸检测。在该系统中，构象受限的ndRC探针通过空间位阻效应防止非特异性环化；只有序列特异性的目标杂交才会引发构象变化，从而允许连接和环化，从而最小化非特异性事件。由此产生的RCT生成串联RNA重复序列，每个重复序列作为crRNA招募并激活Cas12a，触发二次扩增阶段的强烈切割反应。通过将crRNA模板置于探针的锁定结构中，信号生成与目标识别直接相关，从而降低背景噪声。RCR与CRISPR/Cas12a的结合解决了实现超高灵敏度和高特异性的关键问题，使我们的平台适用于需要高检测准确性的应用。
试剂和材料
所有酶（包括T4 DNA连接酶、Exonuclease I、T7 RNA聚合酶和RNase抑制剂）及其相应缓冲液均购自New England Biolabs（美国马萨诸塞州Ipswich）。LbCas12a、10×反应缓冲液I和NTP混合物（25 mM）购自Magigen Biotech（中国广州）。寡核苷酸（详细信息见表S1）购自Sangon Biotech（中国上海）。用于凝胶制备的其他试剂包括30%丙烯酰胺/双缓冲液等。
DL-RCT-Cas12a系统原理
如图1所示，该系统使用一种环状探针（ndRC）。该探针与目标特异性杂交，从而实现T4 DNA连接酶介导的环化。连接后，使用Exonuclease I进行后连接纯化步骤，选择性消化未连接的线性探针，同时保持环状模板的完整性，从而减少非特异性扩增产生的背景信号。环化探针在等温条件下通过T7 RNA聚合酶启动RCR反应。
结论
总之，我们通过DL-RCT-Cas12a系统建立了一个稳健的生物传感平台，该平台利用创新的拓扑探针实现对核酸扩增和CRISPR/Cas12a活性的协同控制。这种整合实现了超灵敏的DNA检测，HPV16 L1的检测限为40.31 aM。由于双锁定探针结构的空间位阻效应，非目标扩增被抑制，后续处理进一步降低了背景噪声。
作者贡献声明
Tiao Han：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿构思。Keyi Long：方法学，正式分析。Wenxi Hu：方法学，正式分析。Meilin Liu：正式分析。Mingyi Guo：项目管理。Danqun Huo：监督，项目管理，资金获取。Changjun Hou：撰写 – 审稿与编辑，项目管理，资金获取。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了四川省科技计划（2022YFSY0013、2025NSFSC2109）和龙泉驿区科技计划（2025LQRD0037）的支持，以及重庆大学分析中心和重庆大学大型设备共享基金的支持。
