《International Journal of Biological Macromolecules》：Human scFv antibodies selected by phage display technology exhibit distinct Zika virus binding profiles and minimal cross-reactivity with dengue virus serotype 2
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为解决寨卡病毒（ZIKV）与其他黄病毒感染临床鉴别诊断困难、检测方法特异性不足的问题，研究人员从噬菌体展示库中筛选出4种人源单链抗体（scFv），并评估了它们对ZIKV抗原的中-高亲和力以及对登革病毒血清型2（DENV2）的低交叉反应性。研究结果发现其中一种scFv（aZV-2）在ELISA和SPR实验中表现出对ZIKV的高特异性结合，其预测表位位于EZIKV的DIII结构域。这项工作为开发更高敏感性和特异性的ZIKV诊断试剂提供了新策略。
一种名为寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）的虫媒病毒，近年来在全球范围内引发公共卫生担忧。它不仅可能导致成人发生格林-巴利综合征，更令人担忧的是，孕妇感染后可能将病毒传播给胎儿，引起小头畸形、先天性畸形甚至胎儿死亡。然而，临床诊断ZIKV感染并非易事，其症状与登革病毒（DENV）等其他黄病毒感染高度相似，难以区分。更棘手的是，由于这些病毒在抗原结构上相似，现有的血清学检测方法常常发生交叉反应，导致假阳性或假阴性结果，影响了诊断的准确性和特异性。开发能够精准区分ZIKV与其他黄病毒（尤其是DENV）的检测工具，因此成为当前传染病诊断领域的一项紧迫挑战。
为了攻克这一难题，一篇发表在《International Journal of Biological Macromolecules》上的研究，从抗体工程的角度出发，探索了新型诊断工具的潜力。研究团队的核心思路是：利用噬菌体展示技术，从庞大的抗体库中“淘选”出能够特异性识别ZIKV病毒颗粒的抗体片段。相比于传统的全抗体，单链可变区片段（single-chain variable fragment, scFv）分子量小、易于在细菌中生产，且由于缺乏Fc段，可减少非特异性结合，是构建诊断试剂的理想元件。这项研究的目标，正是获得对ZIKV具有高亲和力、同时对DENV2具有低交叉反应性的scFv，为未来开发高特异性诊断方法奠定基础。
为了开展这项研究，作者团队运用了几个关键的技术方法。首先，他们使用经紫外线灭活、保留天然蛋白构象的ZIKV全病毒颗粒作为靶标，对一个来源于人源Fab片段的噬菌体展示文库进行了四轮生物淘选，以富集能够结合ZIKV的噬菌体克隆。随后，他们采用了下一代测序（NGS）结合生物信息学分析（使用ATTILA软件），对淘选前后抗体可变重链（VH）和可变轻链（VL）的序列多样性进行分析，并依据富集倍数挑选出最具潜力的VH和VL序列。接着，研究人员通过组合配对，构建了四种不同的scFv（命名为aZV-1至aZV-4），并在大肠杆菌中表达和纯化。抗体的结合特性通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和表面等离子体共振（SPR）进行系统评估，以测定它们对重组ZIKV包膜蛋白（rEZIKV）、ZIKV病毒颗粒以及DENV2病毒颗粒的亲和力与特异性。最后，针对表现最佳的scFv（aZV-2），研究团队还使用了肽段噬菌体展示技术结合EpiSearch生物信息学平台，来预测其识别的E蛋白表位区域。
3.1. 从初始文库中筛选抗ZIKV人源scFvs
研究人员对灭活的ZIKV颗粒进行了四轮生物淘选，以富集展示ZIKV结合性scFv的噬菌体克隆。通过NGS对第0轮（初始文库）和第4轮（富集后文库）的测序数据分析显示，经过淘选，独特的VH和VL序列数量显著减少，表明多样性降低，成功富集了特异性克隆。根据ATTILA软件分析的富集倍数和互补决定区（CDR）差异，筛选出两个VH和两个VL序列，并通过组合配对，构建了四种scFv：aZV-1、aZV-2、aZV-3和aZV-4。
3.2. 在大肠杆菌中表达和纯化重组抗体
四种scFv均在大肠杆菌SHuffle T7 Express菌株中成功表达。通过十二烷基肌氨酸钠（sarkosyl）裂解和镍柱亲和层析纯化，获得了表观分子量约为41 kDa的scFv蛋白。蛋白质印迹（Western Blot）使用抗HA标签抗体确认了重组蛋白的存在。纯度估计在67.9%至83.6%之间，产量在1.4至13.3 mg/L之间。
3.3. 抗原结合能力评估
通过ELISA评估scFv对ZIKV抗原（rEZIKV和灭活ZIKV颗粒）的结合能力，并使用DENV2颗粒和牛血清白蛋白（BSA）评估交叉反应性和非特异性结合。根据曲线下面积（AUC）分析，所有四种scFv均对ZIKV抗原有反应性。其中，aZV-2和aZV-3对ZIKV表现出高反应性，同时对DENV2的结合很低，特异性最佳。aZV-4对ZIKV结合最强，但对DENV2有中等程度的交叉反应。aZV-1对ZIKV的亲和力中等，且对DENV2和BSA有相对较高的反应性。
表面等离子体共振（SPR）动力学分析进一步证实了ELISA结果。aZV-2的解离常数（Kd）为8.14 ± 2.34 nM，显示出高亲和力；aZV-4的Kd最低（2.57 ± 0.85 nM），亲和力最高，但存在交叉反应；aZV-1和aZV-3的Kd值较高，亲和力较低。值得注意的是，尽管所有单克隆抗体（mAbs）都能结合抗原，但斑块减少中和试验（PRNT）显示它们均不具备病毒中和能力。
3.4. 使用肽段噬菌体展示进行表位预测
由于aZV-2在结合ZIKV和低交叉反应性方面表现最佳，被选中通过肽段噬菌体展示预测其结合表位。经过三轮淘选和竞争性ELISA（模拟ELISA），筛选出13个能与rEZIKV竞争结合aZV-2的噬菌体克隆。对其展示的肽段进行测序，并将得到的氨基酸序列与ZIKV E蛋白（PDB ID: 5JHM）进行比对。使用EpiSearch平台预测显示，这些肽段与E蛋白的匹配度很高，预测得分为0.959，核心残基为V364。预测的表位残基主要位于E蛋白的结构域III（DIII），少数位于结构域I（DI），没有位于结构域II（DII）的残基。三维结构分析显示，这些预测的表位残基形成了E蛋白表面的一个不连续构象表位，可能解释了aZV-2对ZIKV的特异性识别。
这项研究通过综合运用噬菌体展示、NGS和生物信息学分析，成功从初始文库中筛选并鉴定了四种人源抗ZIKV的scFv。其中，aZV-2因其对ZIKV抗原的高亲和力（Kd= 8.14 ± 2.34 nM）和对DENV2的极低交叉反应性而脱颖而出，成为最具诊断应用潜力的候选分子。表位预测分析进一步揭示，aZV-2很可能靶向E蛋白DIII结构域上的一个特定区域，这可能是其实现ZIKV特异性识别的结构基础。尽管这些scFv不具备中和病毒的能力，但其高特异性的结合特性使其非常适合用于诊断试剂的开发。
在讨论中，作者强调了使用灭活全病毒颗粒进行淘选在保持抗原天然构象方面的优势，以及NGS在深度分析淘选文库和鉴定高富集克隆方面的强大能力。研究还指出，虽然重链CDR3通常是抗原结合的主要决定因素，但本研究中轻链（VL）的差异对最终抗原结合特异性和交叉反应性产生了关键影响，说明了正确VH-VL配对的重要性。aZV-2识别表位位于DIII的ABDE β-折叠片和C-C′环区域，这些区域被认为是“隐蔽”表位，在成熟病毒颗粒表面的可及性可能有限，这或许解释了其非中和特性，但也可能正是其能避免与DENV2发生交叉反应的原因，因为高度保守的中和表位（如融合环）通常更容易引发交叉反应。
总之，该研究不仅成功获得了具有高特异性的抗ZIKV scFv，还通过表位定位加深了对ZIKV免疫识别机制的理解。aZV-2作为一款高特异性结合试剂，为开发新一代能够准确区分ZIKV与DENV感染的ELISA、免疫层析试纸条或生物传感器等诊断平台提供了重要的核心材料，有助于解决当前黄病毒血清学诊断中交叉反应性高的难题，具有明确的转化应用前景。
