邻近效应催化的碳点膜固定技术实现了高效的免疫原性坏死，从而持续增强围手术期的抗肿瘤免疫作用

《CARBON》：Proximity-Catalyzed Membrane Immobilization of Carbon Dots Enables Efficient Immunogenic Necrosis for Sustained Perioperative Antitumor Immunity

通过工程化铁掺杂碳点（Fe@CDs-T）实现肿瘤细胞膜共价锚定，持续产生自由基激活局部免疫，解决围手术期免疫抑制导致的残留病灶问题。

　　

吴云云|赵胜|孙杰|李琳|向玉熙|谭俊宇|夏大庆|朱静|张吉熙

教育部生物流变科学与技术重点实验室，重庆大学生物工程学院，中国重庆沙正路174号，400044

摘要

外科切除是治疗实体肿瘤的主要方法，但围手术期免疫功能障碍常常会因微小残留病（MRD）而加剧肿瘤复发。基于工程化碳点的围手术期催化免疫疗法策略已被开发出来，以在肿瘤部位维持持续的免疫激活信号。合成了含有酪氨酸官能团的铁掺杂酚类碳点（Fe@CDs-T，约7.0纳米），这些碳点具有异相螯合的Fe-N/O位点，能够有效利用内源性H₂O₂。与对照组碳点不同，Fe@CDs-T在肿瘤微环境中引发了级联反应，生成了短寿命的酚基自由基，并实现了在肿瘤细胞膜上的共价自固定。这种自固定作用使Fe@CDs-T在细胞膜上的保留时间延长至约48小时，而未经酪氨酸修饰的对照组仅为约6小时，从而在膜上持续产生自由基。结果导致显著的脂质过氧化和膜破裂，使细胞坏死率达到49.2%，并有效释放了与损伤相关的分子模式。由此产生的免疫激活作用增强了脾脏中的记忆T细胞（62.3%）和全身抗肿瘤免疫力。同时，Fe@CDs-T的淋巴引流功能使得在手术过程中能够可视化前哨淋巴结，有助于手术导航。通过将短暂的氧化信号转化为持续的膜相关免疫激活，这一纳米平台填补了围手术期的免疫空白，实现了手术前的快速免疫激活和手术后的MRD控制。

引言

围手术期免疫功能障碍不仅由免疫抑制信号引起，还与手术干预导致的局部免疫激活的时间不连续性有关[1]。手术仍然是治疗三阴性乳腺癌等实体恶性肿瘤的主要方法；然而，肿瘤切除引起的组织损伤和全身应激会迅速改变免疫环境[3][4]。在术后早期，伤口愈合过程中的炎症反应和免疫抑制介质的释放会导致一个短暂但关键的免疫抑制期，这可能持续数天到数周，从而促进MRD的生长和随后的转移[5][6][7]。尽管原发肿瘤中含有大量的肿瘤源性新抗原，但手术前启动的免疫激活通常不足以维持一个强大的免疫反应来填补围手术期的免疫空白。因此，在手术干预期间，需要开发能够维持局部免疫激活信号的治疗策略，而不仅仅是诱导短暂的免疫刺激[8][9]。

局部肿瘤免疫调节被认为是一种有效的方法，可以在最大限度地增强免疫反应的同时最小化全身毒性；然而，大多数现有方法仍受其短暂性的限制。针对细胞内细胞器（如线粒体[10][11]、溶酶体[12]和内质网[13]）的催化氧化策略已被开发出来，以诱导肿瘤细胞死亡并产生免疫原性信号。然而，这些方法的有效性高度依赖于细胞的摄取、细胞内滞留时间和催化持续时间，往往导致免疫刺激在空间上广泛但在时间上短暂。此外，在亚细胞水平上触发的凋亡或亚致死应激反应可能无法产生足够持久的危险信号来抵抗术后免疫抑制[14][15]。因此，当前的局部免疫疗法策略往往无法在整个围手术期内维持有效的免疫反应。

与细胞内靶标相比，细胞膜是维持细胞完整性、细胞间通信和免疫识别的重要界面[16]。因此，膜完整性的破坏会引发快速的程序性细胞死亡，并伴随肿瘤抗原和与损伤相关的分子模式的失控释放，从而为免疫激活提供强大的触发信号[17][18]。然而，大多数针对膜的策略依赖于非共价相互作用[19][20]，如静电吸附或配体受体识别，这些作用在体内由于膜流动性、竞争性蛋白质相互作用和动态微环境力的影响而具有热力学可逆性[21][22]。因此，与膜相关的氧化活性和免疫刺激通常是短暂的，需要重复给药，这限制了它们在围手术期的应用[23]。因此，建立一个能够在原位固定在膜上并持续提供局部氧化和免疫信号的稳定催化平台，为克服手术肿瘤切除相关的免疫激活连续性中断提供了有效的解决方案。

基于围手术期免疫功能障碍是由手术干预期间局部免疫激活的时间不连续性驱动这一前提，设计了一种肿瘤局部催化纳米系统，通过原位膜固定来持续保持免疫激活信号。最近，碳点（CDs）由于其可调的光致发光[24][25]、优异的生物相容性和内在的催化活性[27]，已成为癌症诊疗的有希望的纳米平台。特别是，经过改性的异原子掺杂CDs能够模拟各种酶（如过氧化物酶、氧化酶），从而在肿瘤微环境中将内源性肿瘤代谢物转化为治疗效应分子[28]。使用没食子酸和L-酪氨酸作为前体合成了铁掺杂碳点，并引入了异相螯合的Fe-N/Fe-O基团，以实现肿瘤微环境中内源性H₂O₂的有效利用。肿瘤内给药后，通过邻近驱动的催化氧化作用使酪氨酸酚基团生成短寿命的酚基自由基，这些自由基随后通过共价键与肿瘤细胞膜蛋白上的酪氨酸残基结合。这种自固定过程产生了持续的膜相关催化活性，持续破坏细胞膜完整性，并在肿瘤-宿主界面引发快速且程序性的免疫坏死。肿瘤抗原和与损伤相关信号的持续局部释放与围手术期免疫窗口同步，实现了手术前的有效免疫激活和手术后的持续免疫反应。同时，一些碳点通过淋巴管引流到前哨淋巴结（SLNs），延长了手术期间SLNs的可视化识别时间。肿瘤切除后，MRD中的膜锚定催化碳点维持局部氧化应激，并与激活的免疫反应协同作用，抑制MRD和转移生长。总体而言，Fe@CDs-T的持续膜固定通过有效的免疫激活促进了肿瘤坏死，为围手术期MRD控制提供了一种新策略。

部分内容

CDs、Fe@CDs-T和Fe@CDs的合成

简要来说，将不同摩尔比的FeSO₄•7H₂O、Tyr和GA（n(FeSO₄•7H₂O): n(Tyr): n(GA) = 0/0.1/0.5/1/2/3: 2: 1）加入到20毫升去离子水中，混合均匀后转移到聚四氟乙烯内衬的高压釜（100毫升）中，并在180°C下加热16小时。冷却至室温后，于4°C下放置过夜。随后，将所得产物通过0.22微米滤膜过滤，并用截留分子量为1000 Da的透析袋进行透析

铁掺杂碳点（Fe@CDs-T）的特性和催化活性

Fe@CDs-T是通过溶胶热法合成的，使用没食子酸（GA）和L-酪氨酸（Tyr）（摩尔比为2:1）掺杂FeSO₄·7H₂O（n(FeSO₄·7H₂O): n(GA) = 0.1:1, 0.5:1, 1:1, 2:1 和 3:1）。透射电子显微镜（TEM）图像显示Fe@CDs-T呈球形，其平均直径分别为0、0.1、0.5、1、2和3（Fe/Tyr）的掺杂比，约为6.5 ± 5.4纳米至8.5 ± 4.3纳米（图1a，图S1a–e）。通过动态光散射测得的平均水动力尺寸为

结论

总之，本研究建立了一种基于工程化铁掺杂碳点（Fe@CDs-T）的围手术期催化免疫疗法。Fe@CDs-T可以通过肿瘤微环境引发邻近催化反应，从而在肿瘤细胞膜上实现快速的共价自固定。这种锁定和放大机制实现了高度选择性和持久的肿瘤靶向，这与传统的依赖扩散的催化疗法有显著不同。

CRediT作者贡献声明

张吉熙：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调、资金获取、概念构思。朱静：软件开发、方法学设计、数据分析。孙杰：验证、软件应用。赵胜：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、数据分析、数据管理。吴云云：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、软件应用、方法学研究、数据分析、数据管理、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作部分得到了国家自然科学基金（NSFC，项目编号22475028, 22175027）、重庆市技术创新与应用发展计划重点项目（项目编号CSTB2025TIAD-KPX00070）、重庆市自然科学基金（cstc2021jcyj-msxmX0178）以及重庆市研究生研究与创新基金（项目编号CYB240048）的支持。重庆大学的分析与测试中心对此项目给予了大力帮助