基于生物信息学的分子生物标志物鉴定及其初步临床评估，用于淋巴丝虫病的LAMP（环介导从业人员）检测方法

《Frontiers in Tropical Diseases》：Bioinformatics-based identification and preliminary clinical evaluation of molecular biomarkers for LAMP-based diagnosis of lymphatic filariasis

　　**摘要**
淋巴丝虫病（LF）主要由班氏吴策线虫（Wuchereria bancrofti）引起，需要快速准确的诊断方法来支持根除计划，尤其是在资源有限的环境中。本研究展示了开发并验证了一种基于环介导等温扩增（LAMP）的技术，用于检测班氏吴策线虫DNA。我们利用生物信息学驱动的目标选择方法，确定了五个仅针对班氏吴策线虫的基因标记物。该检测方法在加标的血液样本中能够达到皮克的检测限，从而降低了假阳性率，并且没有与马来布鲁线虫（Brugia malayi）、帕汉吉布鲁线虫（Brugia pahangi）、犬心丝虫（Dirofilaria immitis）以及其他细菌和真菌病原体的DNA发生交叉反应。使用酚红进行的比色读数使得结果易于直观解读，无需特殊仪器；而即用型混合液则提高了检测的便利性和一致性。通过将班氏吴策线虫DNA加入到人类血液样本中模拟实际病例，进一步验证了LAMP检测方法的有效性。此外，还对8名LF患者样本进行了初步的临床评估。LAMP检测方法兼具高灵敏度和特异性，从样本采集到得出结果只需30–60分钟。这种基于视觉读数的即时检测方法适用于流行地区和资源有限环境中的班氏吴策线虫感染的监测和管理。

**1. 引言**
淋巴丝虫病（LF）是一种由班氏吴策线虫、马来布鲁线虫和帝汶布鲁线虫（Brugia timori）感染引起的衰弱性热带疾病。这些寄生虫通过受感染的蚊子叮咬进入人体，主要传播媒介为库蚊属（Culex）、伊蚊属（Aedes）和按蚊属（Anopheles）的蚊子。LF是全球长期残疾的重要原因，目前有超过5400万人受影响，分布在72个流行国家中。据估计，约有1.29亿人感染了LF，其中4.85亿人处于风险之中，其中4300万人出现了疾病的症状（如淋巴水肿、鞘膜积液和象皮病）。这些症状给患者带来了巨大的身体、心理和社会经济负担，尤其是在亚洲、非洲、美洲和太平洋地区的流行区域。LF对热带和亚热带地区的边缘化社区影响尤为严重，这些地区的医疗资源通常较为匮乏。

LF的发病机制涉及复杂的宿主-寄生虫相互作用，导致淋巴系统逐渐功能丧失。成年丝虫的持续感染会引发慢性免疫介导的炎症，进而导致淋巴管扩张和阻塞，最终形成淋巴水肿，常见于四肢、乳房或生殖器。反复发作的皮肤淋巴管腺炎（ADLA）会加剧淋巴损伤，促进纤维化、皮肤增厚和象皮病的发生。鞘膜积液是男性常见的慢性症状。通过影像学检查可以发现亚临床的淋巴损伤。皮肤变化包括急性皮炎，而在晚期阶段会出现角化过度、色素沉着改变以及由于纤维化和慢性炎症导致的皮肤呈鹅卵石状。LF每年导致约525万人丧失健康生活，造成约25亿美元的经济损失，主要源于长期残疾和劳动力参与度的下降。意识到LF对公共卫生和经济的重大影响，世界卫生组织（WHO）于2000年启动了全球淋巴丝虫病消除计划（GPELF），目标是在2030年前彻底根除该疾病。该计划通过大规模药物干预（MDA）来阻断疾病传播，并为已感染者提供疾病管理和残疾预防服务。每年使用两种药物（ albendazole与diethylcarbamazine联合使用或ivermectin）进行4–6年的治疗被认为是最佳的根除策略。早期和准确的诊断对于制定有效的治疗策略、控制传播以及最终消除LF这一公共卫生问题至关重要。引起人类丝虫病的病原体包括班氏吴策线虫、马来布鲁线虫、帝汶布鲁线虫、洛阿丝虫（Loa loa）、曼森虫属（Mansonella perstans和Mansonella ozzardi）以及盘尾丝虫（Onchocerca volvulus）。

WHO的GPELF计划自2000年启动以来取得了显著进展，感染率降低了74%。在最近于基加利举行的GAELF 2025会议上，强调了持续进行大规模药物干预、改进疾病管理和加强验证后监测的紧迫性。结合新型诊断方法来检测班氏吴策线虫，将是实现WHO 2030年消除LF目标的关键。在印度，99.4%的LF病例由班氏吴策线虫引起，马来布鲁线虫仅占0.6%。精确的临床诊断具有挑战性，目前尚无便捷、高灵敏度且成本效益高的专门实验室检测方法。

传统的微丝蚴寄生虫学检测方法存在固有的缺点和挑战，包括灵敏度低、无法检测微丝蚴密度较低的个体以及需要夜间采集血液样本（而这正是微丝蚴最活跃的时间）。传统的LF诊断方法主要依赖于吉姆萨染色厚血涂片中的微丝蚴观察。尽管显微镜检查被认为是检测LF的金标准，但它存在劳动密集、依赖操作者以及不适合高通量监测等问题，特别是在慢性感染者或低寄生虫血症患者中。最近，韩国SD Biosensor公司开发了一种新的快速检测班氏吴策线虫抗原的卡片格式测试（Standard Q Filariasis Antigen Test, QFAT），解决了显微镜方法的多个问题和局限性。基于血清学的重组WbSXP-1和BmSXP-1抗体检测方法显示比寄生虫学方法更高的灵敏度；然而，这些方法耗时且成本较高，并可能与其他丝虫病原体发生交叉反应，从而限制了其诊断特异性。

多种先进的分子技术（如PCR、qPCR）和蛋白质技术（如LC-MS）已被用于检测班氏吴策线和马来布鲁线虫。以往的研究使用了ssa I基因（24–28）、tph 1基因（29, 30）、IWb 35重复序列（31）、pWb 12重复序列（32）和Long DNA重复序列（LDR）来进行LF患者的检测。同样，Hha I DNA重复序列的qPCR也被用于检测马来布鲁线虫，其灵敏度高于IgG4测试（36）。此外，基于HRM的qPCR技术能够在一个试管中同时检测并区分四种丝虫：班氏吴策线虫、马来布鲁线虫、帕汉吉布鲁线虫和犬心丝虫（37）。在丝虫病流行地区进行的LC-MS研究在班氏吴策线虫感染的库蚊中发现了两种蛋白质（7 kDa和66 kDa）。然而，由于需要高规格的实验室设施、昂贵的试剂和受过训练的人员，这些分子技术在流行地区的应用受到限制。因此，迫切需要开发出更具灵敏度和特异性、成本效益高且适用于现场检测的替代诊断策略。

环介导等温扩增（LAMP）是一种有前景的分子诊断方法。LAMP能在等温条件下快速、灵敏且经济高效地扩增DNA，无需复杂的温度控温器。最近的一项研究使用基于ssa I基因的LAMP技术在肯尼亚的人类血液样本中检测到了班氏吴策线虫，灵敏度为92.3%，特异性为97.3%。但由于交叉污染和引物二聚体的形成，该方法存在假阳性结果。Tagaki等人也使用基于视觉浊度的ssa I LAMP方法检测了人类血液样本中的班氏吴策线虫，但这种方法在资源有限的环境中可能受主观因素影响，无法检测到弱阳性样本。另一项研究使用基于LDR的比色LAMP方法检测人类血液中的班氏吴策线虫DNA，高重复序列提高了灵敏度，但也导致了假阳性扩增，降低了诊断特异性。LAMP方法的视觉读数使其非常适合资源匮乏环境中的即时检测应用。

我们利用生物信息学方法确定了五个具有高度保守序列的班氏吴策线虫基因目标，开发出一种灵敏且特异的LAMP检测方法。这些基因此前从未被用作LF检测的生物标志物。本研究成功验证了LAMP方法在加标血液样本和有限但真实的LF患者血液样本中的有效性，显示出高灵敏度和特异性，能够在30–60分钟内快速检测出班氏吴策线虫。此外，LAMP方法与马来布鲁线虫、帝汶布鲁线虫和帕汉吉布鲁线虫无交叉反应。这种新型诊断方法代表了抗击LF的重要进展，提供了一种适用于资源有限环境的即时检测解决方案，为全球根除LF的努力做出了贡献。

**2. 材料与方法**
**2.1 基于生物信息学方法的新基因鉴定**
我们使用系统的生物信息学方法分析了班氏吴策线虫和马来布鲁线虫的基因组、转录组和蛋白质组数据，以确定用于检测班氏吴策线虫的独特基因目标。从公共数据库（包括美国国家生物技术信息中心NCBI）获取了高质量的、带有注释的基因组组装和转录组数据。通过比较基因组分析，排除了可能导致非特异性扩增的同源区域，确保了检测的特异性。使用BLAST搜索将序列与人类（Homo sapiens）、常见细菌（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）和真菌（白色念珠菌和烟曲霉）的基因组进行比对。使用CLC Sequence Viewer 8.0进行了多次序列比对，以识别LF病原体中的保守区域。这些保守区域被作为引物设计的潜在目标。候选基因根据阶段特异性表达、功能重要性、非目标生物体中无同源序列以及是否适合LAMP引物设计进行排序。转录组数据分析了成虫和微丝蚴阶段的高表达基因，功能性注释用于选择对寄生虫生存和繁殖至关重要的基因。评估了基因区域的GC含量、序列长度和重复元素的存在情况。本研究的工作流程图见图1。最终选定的基因经过进一步的计算机验证，确定了用于LAMP引物设计的候选基因，详见补充表1。

**2.2 LAMP引物设计**
LAMP引物使用NEB LAMP Primer Design Tool（https://lamp.neb.com/）设计，这是一种专门用于环介导等温扩增的工具。引物组包含4–6个引物，分别针对选定基因的不同区域，包括正向内引物（FIP）、反向内引物（BIP）、正向外引物（F3）、反向外引物（B3）、环状正向引物（LF）和环状反向引物（LB）。每个引物都经过设计，以确保能够特异性识别目标序列并高效扩增。评估了引物的热力学稳定性、熔解温度兼容性及扩增效率。使用NEB LAMP Primer Design Tool计算了引物的熔解温度（Tm），以确认其与反应条件的兼容性，并最小化了二级结构（如发夹结构和引物二聚体的形成）。通过BLAST搜索进一步验证了引物的特异性，确认其不会与非目标生物体发生非特异性结合。选择具有高扩增效率、热力学稳定性和低二级结构的引物序列进行实验验证。所设计的引物基于班氏吴策线虫基因组中的特定基因序列，并在印度班加罗尔的Sigma-Aldrich公司合成。潜在基因目标的引物序列列于表1（LAMP阳性）和补充表2（LAMP阴性）中。

**2.3 特定基因目标的重组吴策线虫质粒构建**
尽管多次尝试从商业供应商、研究机构和印度临床实验室获取班氏吴策线虫基因组DNA均未成功，我们采取了替代策略来开发基于LAMP的检测方法。从NCBI数据库中检索了班氏吴策线虫的特异性基因序列，选择一个高度保守且具有诊断意义的基因组区域。该序列通过标准分子克隆协议合成，并生成了重组构建体。这些重组构建体被转化进入具有转化能力的E. coli DH5α细胞中，随后通过限制性酶切进行筛选和验证，通过Sanger测序（GenScript，新泽西州，美国）确认了插入序列的存在。因此，使用了重组的W. bancrofti质粒来优化和验证LAMP检测方法。

2.4 LAMP检测方法的优化
在印度金奈的Precision Scientific水浴中，使用NEB公司的WarmStart? Colorimetric Master Mix试剂盒（马萨诸塞州伊普斯维奇），进行了一系列LAMP反应条件优化研究，以评估最佳的检测参数。优化条件包括温度（60°C、63°C、65°C、70°C）、反应时间（15分钟、30分钟、45分钟、60分钟）以及LAMP引物的工作浓度[F3/B3（0.1 μM、0.2 μM、0.4 μM）、FIP/BIP（0.8 μM、1.6 μM、3.2 μM）、LF/LB（0.2 μM、0.4 μM、0.8 μM）。实验中使用的参考DNA浓度保持在40 ng，最终反应体积为25 μl，使用无核酸酶的水配制。首先在保持其他条件不变的情况下进行温度优化，以确定最佳的扩增条件。扩增完成后，反应样品在80°C下热失活10分钟。每个实验重复三次，并包括无模板对照（NTC）以确保结果的可靠性及无污染。反应产物通过2%琼脂糖EtBr凝胶电泳并在紫外光下观察显色结果。

2.5 参考样本和加标血液样本的LAMP检测反应条件
使用NEB公司的WarmStart? Colorimetric LAMP 2X Master Mix试剂盒和优化后的LAMP引物浓度，进行了彩色环介导等温扩增（LAMP）检测。反应混合物的总体积为25 μl，包含12.5 μl的WarmStart? Colorimetric LAMP 2X Master Mix、2.5 μl的10X LAMP引物混合物（0.2 μM F3/B3、1.6 μM FIP/BIP、0.4 μM LF/LB）、1 μl的参考DNA或从加标血液样本中提取的DNA以及9 μl的分子生物学级水（Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆）。还包括无模板对照（NTC）反应，其中DNA模板被等体积的无核酸酶水替代。通过移液充分混合反应组分以确保均匀性。观察溶液颜色，明亮的粉红色表示成功的彩色LAMP反应所需的高初始pH值。反应管密封以防蒸发，并在65°C的水浴中孵育30分钟。扩增完成后，反应样品在80°C下热失活10分钟。取出试管后，通过颜色变化直观评估反应结果，这是一种快速且无需设备的结果解读方法。使用摄影记录下颜色变化的结果，并将扩增的LAMP产物在2%琼脂糖EtBr凝胶上进行电泳并记录下来。

2.6 LAMP检测方法的灵敏度和特异性确定
通过分析从加标血液样本中提取的参考DNA的10倍系列稀释液，确定了使用优化后的LAMP检测方法可检测到的最小丝虫基因组DNA量。准备了六种浓度以评估检测方法的分析灵敏度：40 ng/μl、4 ng/μl、400 pg/μl、40 pg/μl、4 pg/μl、0.4 pg/μl、0.04 pg/μl和0.004 pg/μl。检测限（LoD）定义为始终产生阳性扩增结果的最低DNA浓度。每种浓度重复三次以确保再现性。通过肉眼观察LAMP结果，并将扩增的LAMP产物在2%琼脂糖EtBr凝胶上进行电泳。

2.6 LAMP检测方法的特异性评估
使用一组细菌和真菌病原体以及阳性对照，评估了LAMP检测方法的特异性。测试的生物体包括商业可获得的B. malayi（BEI Resources，NR-44346）、B. pahangi（BEI Resources，NR-46542）和D. immitis（BEI Resources，NR-42493）的基因组DNA，这些样本均来自美国弗吉尼亚州的BEI Resources公司。由于W. bancrofti的基因组DNA无法商业购买，我们设计并制备了定制的W. bancrofti质粒作为阳性对照。此外，还准备了来自不同病原体的基因组DNA，包括Enterococcus faecalis、Staphylococcus aureus、Micrococcus luteus、Streptococcus pneumoniae、Klebsiella pneumoniae、Acinetobacter baumannii、Escherichia coli、Pseudomonas aeruginosa、Candida albicans和Cryptococcus neoformans。根据制造商的说明书，使用PureLink Genomic DNA迷你试剂盒（Thermo Fisher，马萨诸塞州沃尔瑟姆）从每种病原体中提取基因组DNA。使用UV分光光度计（Multiskan SkyHigh，Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州）测量提取基因组DNA的纯度（A260/A280）和浓度。在优化条件下，以25 μl的反应体积准备了LAMP反应混合物，其中包含彩色LAMP主混合物、10X基因特异性LAMP引物及各病原体的DNA模板。还包括无模板对照（NTC）反应，以监测评估检测性能和引物二聚体污染情况。在优化LAMP条件下进行扩增，并记录LAMP结果。LAMP检测方法显示出更高的灵敏度和特异性、快速检测能力，以及适合现场使用的特性，证实了其作为淋巴丝虫病诊断工具的潜力。

2.7 用LAMP检测方法对感染LF患者血液样本的临床评估
在印度奥里萨邦Balangir，使用EDTA包 coating的容器收集了5mL无症状微丝蚴血症个体的外周血。通过印度奥里萨邦卫生部的常规夜间血液调查（NBS），确定了8名LF阳性患者（3名男性和5名女性，年龄在26至75岁之间）。样本在晚上9:00至11:00之间采集，立即运输到实验室并在4°C下保存，直至进一步使用。整个过程（包括样本采集、运输和分析）均在获得印度奥里萨邦卫生服务局的必要批准和伦理许可后进行（伦理许可编号：22629/MS-2-IV-01/2024，日期为2024年8月27日）。使用商业DNA提取试剂盒（Invitrogen，加利福尼亚州）从LF患者的血液样本中提取基因组DNA。考虑到丝虫虫体的结构特性，采用了4小时的延长裂解程序以确保有效破坏寄生虫细胞壁并释放核酸。裂解后按照制造商的说明提取DNA，确保去除杂质和抑制剂。使用分光光度计（Multiskan SkyHigh，Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州）测量提取DNA的纯度和浓度。根据前述条件，将提取的DNA用于LAMP检测。通过颜色变化监测等温扩增，并与参考对照相比评估检测性能。这一临床验证步骤确立了所开发的LAMP检测方法适用于直接检测LF患者血液样本中的W. bancrofti。

3 结果
3.1 使用生物信息学方法识别LF特异性基因靶标和LAMP引物
为了确保LAMP检测方法对W. bancrofti（LF的致病因子）的高度准确性和特异性，进行了广泛的生物信息学分析，以识别与该寄生虫独特的基因特异性标记物。通过查询公开的基因组和序列数据库，进行了全面的但聚焦的基因组筛选和标记物选择，以鉴定新的LF基因特异性靶标。这种方法有效排除了先前发表的与其它寄生虫共有的LF基因和序列，从而最小化了检测中的交叉反应可能性。共鉴定出11个新的LF基因，其中5个基因特异性靶标（rnpB、ftsZ、mutM、mraY、dapF）使用CLC Sequence Viewer 8.0、MEGA X等生物信息学工具被证实为LAMP阳性。根据这些基因特异性靶标设计了LAMP引物，并因其优异的诊断潜力而选用于LF基因特异性引物的设计及检测方法的开发。这5个基因标记物已被申请专利并发表（WO/2025/169005，日期为2025年8月14日）。

3.2 LAMP检测方法的优化结果
优化LAMP反应条件确定了检测丝虫因子的最佳引物浓度和反应温度。最佳引物浓度为F3/B3 0.2 μM、FIP/BIP 1.6 μM、LF/LB 0.4 μM，在30分钟内实现完全扩增（见表2）。除了引物优化外，65°C的反应温度也被确定为最佳的扩增和特异性温度，同时防止非特异性扩增（表2）。优化的反应条件一致产生了清晰、特异性的扩增结果，在三次重复实验中均未观察到交叉反应。这些结果证实了优化后的LAMP检测条件的稳健性和可靠性，能够准确且敏感地检测丝虫寄生虫。

表2 优化研究中测试的反应条件
参数 测试条件
孵育温度 60°C 63°C 65°C 70°C
孵育时间 15分钟 30分钟 45分钟 60分钟
F3/B3引物浓度 0.1 μM 0.2 μM 0.4 μM
FIP/BIP引物浓度 0.8 μM 1.6 μM 3.2 μM
LF/LB引物浓度 0.2 μM 0.4 μM 0.8 μM
使用彩色LAMP检测方法检测W. bancrofti的优化研究。# 优化研究中获得的最佳值以粗体表示。

3.3 LAMP检测方法在实验室中的验证
使用识别的基因标记物进行LAMP检测，以评估其灵敏度和特异性。对于基因靶标的灵敏度测试表明，该方法能够检测到低至0.4 pg的丝虫DNA（rnpB基因）、4 pg的丝虫DNA（ftsZ基因）、4 pg的丝虫DNA（mutM基因）、4 pg的丝虫DNA（mraY基因）和0.4 pg的丝虫DNA（dapF基因），满足了识别早期感染阶段低寄生虫载量的必要灵敏度阈值（图2）。在丝虫DNA存在的情况下，酚红从亮粉色变为黄色，确认LAMP反应为阳性；而在无DNA模板的情况下颜色保持粉色，表明LAMP反应为阴性。这种无需复杂仪器的肉眼可见颜色检测方法适用于资源匮乏的环境。通过重复三次LAMP检测验证了重复性和一致性。阳性对照（Tube 2）也包含在所有实验中。

3.4 使用加标血液样本验证LAMP检测方法
为了模拟血液环境中/临床样本中的检测性能，我们在100 μl正常人血液中添加了40 ng至0.004 pg的丝虫DNA，然后进行LAMP检测。提取的DNA用于后续的LAMP实验。LAMP检测成功且特异性地扩增了所有五个基因特异性靶标的丝虫DNA，证明了其在血液样本中准确检测丝虫DNA的能力（表2）。然而，在血液存在的情况下，LAMP检测的灵敏度对于某些基因特异性靶标降低了10到100倍，但特异性仍然保持不变。尽管如此，在血液存在的情况下，该方法仍表现出较强的稳健性和适用性。所有实验均包括阳性对照和无模板对照（NTC），以确保结果的特异性和可靠性。LAMP检测重复三次，所有实验结果一致且可重复，证实了其稳健性和准确性。扩增的LAMP产物也在2%琼脂糖Et-Br凝胶上进行了电泳并记录下来。LAMP阳性反应表现为梯状图案（补充图1）。

图2 在实验室条件下验证LAMP检测方法检测丝虫DNA的情况。(A-E) 显示了使用优化后的LAMP引物和反应条件，对参考DNA进行10倍稀释（试管3-10）后的LAMP结果。丝虫DNA的存在通过颜色从亮粉色变为黄色来确认，表示LAMP阳性（+）结果；而无丝虫DNA的情况下试管仍保持亮粉色，表示LAMP阴性（-）结果。所有反应中还包括无模板对照（Tube 1），以验证引物二聚体的存在。阳性对照（Tube 2）也包含在所有LAMP实验中。

3.4 使用加标血液样本验证LAMP检测方法
为了模拟血液环境/临床样本中的检测情况，我们在100 μl正常人血液中添加了不同浓度的丝虫DNA（范围从40 ng至0.004 pg），然后进行DNA提取并用于LAMP检测实验。LAMP检测成功且特异性地扩增了所有五个基因特异性靶标的丝虫DNA，证明了其在血液样本中准确检测丝虫DNA的能力（表2）。然而，在血液存在的情况下，LAMP检测的灵敏度对于某些基因特异性靶标降低了10到100倍，但特异性仍然保持不变。尽管如此，在血液存在的情况下，该方法仍表现出较强的稳健性和适用性。所有实验均包括阳性对照和无模板对照（NTC），以确保结果的特异性和可靠性。LAMP检测重复三次，所有实验结果一致且可重复，证实了其稳健性和准确性。在加标血液样本中，LAMP的灵敏度分别为rnlB基因4 pg、ftsZ基因40 pg、mutM基因400 pg、mraY基因4 pg、dapF基因40 pg，满足了检测低寄生虫载量的必要灵敏度阈值（图3）。这些实验突显了该检测方法在 spiked 血样中检测丝虫 DNA 的灵敏度，为在类似实地条件下检测丝虫感染提供了实用可靠的工具。结果通过颜色变化标准（从粉红色到黄色）进行视觉解读。总结来说，所有五个基因靶标（rnpB、ftsZ、mutM、mraY 和 dapF）都以皮克级别的灵敏度被检测到（表 3）。扩增的 LAMP 产物也在 2% 的琼脂糖 Et-Br 凝胶上得到了确认并记录下来。LAMP 阳性反应表现为梯状图案（补充图 2）。图 3 使用模拟实际条件的 spiked 血样验证了 LAMP 检测丝虫 DNA 的能力。（A-E）展示了在 spiked 前对每个丝虫基因靶标进行 10 倍稀释后获得的 LAMP 结果（试管 3-10），使用的模板范围为 40 ng 到 0.004 pg，并采用优化的 LAMP 引物和反应条件。丝虫 DNA 的存在通过从亮粉色到黄色的颜色转变得到确认，表明 LAMP 结果为阳性（+），而缺乏丝虫 DNA 时仍保持亮粉色，表明 LAMP 结果为阴性（-）。所有反应中都包含了无模板对照（试管 1），以确认没有引物二聚体的污染。所有 LAMP 实验中也包含了阳性对照（试管 2）。

表 3
S. 基因名称
LAMP 检测
Spike 检测
灵敏度变化
参考 DNA
Spike 检测
1rnpB++
0.4 pg
4 pg
2ftsZ++
4 pg
40 pg
3mutM++
4 pg
400 pg
4mraY++
4 pg
40 pg
5dapF++
0.4 pg
40 pg

使用比色 LAMP 检测检测马来丝虫（LF）的 5 个潜在基因靶标列表。‘+’ 表示 LAMP 阳性反应，pg 为单位。

3.5 LAMP 检测的特异性
还对五个 LAMP 阳性基因靶标（rnpB、ftsZ、mutM、mraY 和 dapF）针对一系列细菌和真菌病原体的 DNA 进行了特异性检测。我们观察到这些基因没有与其他细菌或真菌病原体发生交叉反应，从而确认了 LAMP 检测丝虫 DNA 的特异性（图 4）。

图 4 使用其他丝虫寄生虫、细菌和真菌病原体面板评估 LAMP 检测的特异性。LAMP 检测中的试管分别代表：1- 菲律宾班克氏丝虫（B. pahangi），2- 班克罗夫特丝虫（W. bancrofti，阳性对照），3- 伊米蒂丝虫（Dirofilaria immitis），4- 马来丝虫（B. malayi），5- 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），6- 黄色微球菌（Micrococcus luteus），7- 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae），8- 肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae），9- 鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii），10- 大肠杆菌（Escherichia coli），11- 绿脓假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），12- 白色念珠菌（Candida albicans）和 13- 新型隐球菌（Cryptococcus neoformans），以及 14- 无模板对照（NTC）。LAMP 检测中未包含模板对照，以检查引物二聚体的污染。

3.6 使用感染马来西亚丝虫患者的样本对 LAMP 检测进行临床评估
使用五种已识别的班克罗夫特丝虫基因靶标进一步评估了 LAMP 检测。在这些靶标中，只有两个基因靶标（rnpB 和 dapF）在 8 个患者样本中的 6 个样本中一致产生了阳性扩增信号（图 5），而其余三个靶标（ftsZ、mutM、mraY）在任何患者样本中均未检测到扩增。这些基因靶标的差异性能可能由多种技术和生物学因素解释。首先，目标基因的丰度在基于核酸的检测方法中起着关键作用；两个阳性靶标的存在可能表明这些基因表达量较高，从而提高了灵敏度。相反，阴性靶标可能对应于这些患者的寄生虫负荷较低，导致没有扩增。在未感染的人类样本中未观察到扩增，证明了所开发的 LAMP 检测的稳健性。

图 5 使用 8 个感染马来西亚丝虫患者的样本对 LAMP 检测进行初步临床评估。（A-E）展示了从 8 个感染马来西亚丝虫患者中的 6 个样本（试管 5-12）以及未感染的人类血液样本（试管 3、4）获得的 LAMP 结果。丝虫 DNA 的存在通过从亮粉色到黄色的颜色转变得到确认，表明 LAMP 结果为阳性（+），而缺乏丝虫 DNA 时仍保持亮粉色，表明 LAMP 结果为阴性（-）。所有反应中都包含了无模板对照（试管 1），以确认没有引物二聚体的污染。所有 LAMP 实验中也包含了阳性对照（试管 2）。在未感染的人类血液样本中未观察到扩增，证明了所开发的 LAMP 检测的稳健性。

4 讨论
尽管取得了显著进展，但马来西亚丝虫病仍是一种致残的热带疾病，在流行国家构成了巨大的公共卫生问题。尽管马来西亚丝虫病的诊断和消除计划已经取得了显著进展，但准确的诊断对于有效的疾病控制和管理消除计划仍然至关重要。此外，我们需要在资源有限的环境中快速且可在现场部署的诊断工具。虽然传统的显微镜检查血液涂片中的微丝虫仍然是金标准，但免疫学和分子诊断工具（如 PCR 和 qPCR）的显著进步彻底改变了马来西亚丝虫病的诊断和现场监测计划，尤其是在 MDA 消除计划后检测低水平感染方面。传统的诊断方法（如显微镜检查、抗原检测和核酸扩增测试）虽然有效，但通常受到对广泛基础设施、专业仪器、受过培训的人员和复杂协议的依赖限制。

在本研究中，我们成功开发并验证了一种快速、高度敏感和特异的 LAMP 检测方法，用于检测班克罗夫特丝虫。LAMP 检测克服了许多这些挑战，并作为一种具有简单视觉比色读数的稳健分子诊断工具展现出潜力。LAMP 检测开发的早期阶段集中在使用生物信息学方法来识别班克罗夫特丝虫特异性基因靶标上。通过对班克罗夫特丝虫的全基因组进行计算机筛选，基于物种间的序列保守性和非目标生物中的同源基因的存在，确定了五个班克罗夫特丝虫特异性基因靶标。设计的 LAMP 引物序列使用 BLASTn 分析在公开可用的沃尔巴克氏体基因组组装中进行了评估，未在其他沃尔巴克氏体菌株的引物结合区域内发现显著同源性。生物信息学和比较基因组学方法使得能够实现班克罗夫特丝虫的特异性，从而最小化了与其他寄生虫、细菌和真菌物种的交叉反应风险。使用 spiked 人血样对 LAMP 检测进行的分析验证显示灵敏度略有下降，但仍保持了 pg/ml 的灵敏度和类似的特异性。Spike LAMP 检测对非目标生物（包括细菌、寄生虫和真菌病原体）表现出出色的特异性。LAMP 检测没有与相关的丝虫病原体（包括马来丝虫、菲律宾班克氏丝虫和伊米蒂丝虫）发生交叉反应。这些提高的灵敏度和特异性归因于检测方法的优化，包括在 spiked 血样中始终检测到阳性的五个单独基因特异性标记物（rnpB、ftsZ、mutM、mraY 和 dapF）。

这些结果得到了 Notomi 等人（42）和 Laohasinnarong（43）先前报告的证实，强调了基于 LAMP 的检测系统的特异性。此外，所有基因标记物在三次技术重复实验中的可重复性都显示出准确的结果，表明 LAMP 检测的稳健性，这是现场应用的关键要求。基于酚红的比色检测系统通过提供简单的视觉读数显著提高了 LAMP 检测的可用性。这种简单的低成本读数，通过从亮粉色到黄色的颜色变化来表示，消除了对复杂可视化设备（如凝胶电泳、荧光计和 PCR/RT-PCR 机器）的需求。与其他视觉指示剂（如 calcein（44）和 hydroxynaphthol blue（45）类似，这使得没有专门培训的人员也能快速评估特定反应，从而便于在资源有限和流行环境中应用该检测方法。

与传统诊断技术相比，LAMP 检测具有多种优势。相比传统显微镜检查，LAMP 检测提供快速、准确且灵敏度更高的结果，而传统显微镜检查受时间和技术人员依赖性影响，并且对低寄生虫负荷感染的灵敏度较低。此处报告的 LAMP 检测即使在模拟现场条件的血样中也具有 pg/ml 的灵敏度。在 spiked 血样中，LAMP 的灵敏度分别为：rnpB 基因 4 pg，ftsZ 基因 40 pg，mutM 基因 400 pg，mraY 基因 4 pg，dapF 基因 40 pg，满足了在社区中检测低寄生虫负荷所需的灵敏度阈值。此外，尽管 PCR 和 qPCR（最广泛使用的分子检测方法）需要热循环仪和专门培训，但 LAMP 可以在等温条件下进行，基础设施要求较低。Loop 引物进一步提高了扩增效率和特异性，正如 Nagamine 等人（46）先前报道的那样。

LAMP 检测的优化使得开发出即用型混合液成为可能，从而最小化了与手动试剂准备相关的变异性。这种易于理解的配方对于在现场条件下实现一致性并减少错误至关重要。LAMP 检测的快速周转时间对于实时诊断和大规模监测工作非常有利，旨在早期发现和控制疾病。此外，LAMP 检测在三次重复实验中显示出一致的扩增。重复性（ within-assay precision）和再现性（inter-assay precision）评估显示，在所采用的实验条件下扩增时间没有变化，表明检测方法具有较高的重复性和再现性。独立观察者之间没有观察到 LAMP 检测结果的不一致解读。

使用 8 份马来西亚丝虫患者样本 DNA 进行了初步临床评估。在临床条件下，8 份马来西亚丝虫患者样本 DNA 中有 6 份对两个基因靶标（rnpB 和 dapF）显示出阳性 LAMP 扩增。图 5 中的两个阴性患者样本（试管 8 和 9）未出现 LAMP 扩增，这可能是由多种技术和生物学因素引起的。首先，这些样本中的微丝虫负荷可能低于检测方法的分析灵敏度，因为马来西亚丝虫感染的寄生虫负荷根据疾病阶段和微丝虫的夜间周期性而变化很大。其次，尽管进行了延长的裂解步骤，但这些样本中的 DNA 提取效率可能因丝虫细胞的部分裂解而降低，导致目标 DNA 的回收量减少。此外，在未感染的人类血液样本（图 5 中的试管 3 和 4）中也未观察到扩增，进一步证明了所开发的 LAMP 检测的稳健性。因此，LAMP 结果清楚地表明了两个经过验证的基因靶标（rnpB 和 dapF）在临床样本中可靠地检测班克罗夫特丝虫 DNA 的稳健性。总体而言，临床评估确认 LAMP 检测使用两个基因靶标（rnpB 和 dapF）似乎具有足够的稳健性，可以直接从患者血液样本中高特异性和灵敏度地检测班克罗夫特丝虫 DNA。然而，我们仅使用有限数量的临床样本（八个）测试了 LAMP 检测；需要使用更多马来西亚丝虫患者血液样本进行进一步的稳健临床验证。

当前研究存在以下局限性。由于临床马来西亚丝虫患者样本量有限以及缺乏分子比较，限制了诊断灵敏度和特异性的正式估计。尽管在检测验证过程中使用了传统的 DNA 提取方法，但 LAMP 化学方法允许与简化的样本准备方法兼容。分析验证使用了克隆的目标 DNA，因此无法确定实时检测的灵敏度。这可能会限制与基于全基因组 DNA 标准的研究进行直接比较。在未来的研究中包含量化班克罗夫特丝虫基因组 DNA 将允许估计基因组当量，并为与已建立的分子检测方法进行比较提供更直接的基础。因此，目前的发现需要更大规模的前瞻性队列研究，以评估诊断准确性并明确 LAMP 检测在淋巴丝虫病监测和消除工作中的潜在应用。

5 结论
此处报告的 LAMP 检测代表了一种升级淋巴丝虫病分子诊断的创新方法。我们使用 spiked 马来丝虫样本进行了实验室验证，并使用八份感染的临床 Malaysia 丝虫患者样本进行了初步临床评估。我们的结果表明，LAMP 检测是一种快速、敏感、成本效益高且可在现场部署的分子诊断工具，专门用于检测班克罗夫特丝虫。使用感染马来西亚丝虫患者样本验证的结果表明，两个基因靶标（rnpB 和 dapF）是临床应用中可靠的分子标记物，同时也强调了优化样本准备和提高低寄生虫负荷情况下 LAMP 检测灵敏度的必要性。因此，当前研究为 LAMP 检测在淋巴丝虫病床旁诊断中的转化潜力提供了关键证据。通过进一步改进和大规模评估，LAMP 检测将作为一种稳健的、可在现场部署的诊断工具，可以与马来西亚丝虫病根除和 MDA 后监测计划结合起来。这种快速的床旁 LAMP 检测可以作为一种重要测试，支持世界卫生组织（WHO）到 2030 年消除淋巴丝虫病的全球计划（GLFEP）。