代谢失衡触发小鼠单倍体胚胎干细胞的适应性重塑以加速二倍体化

《Advanced Science》：Metabolic Imbalance Triggers Adaptive Remodeling to Accelerate Diploidization in Murine Haploid Embryonic Stem Cells

本研究聚焦小鼠单倍体胚胎干细胞（haESC）在培养过程中自发二倍体化（self-diploidization）这一制约其应用的瓶颈问题，通过多组学分析、线粒体功能评估和全基因组筛选等手段，系统探究了代谢重塑在此过程中的驱动作用。研究发现，haESC中线粒体功能障碍、活性氧（ROS）过载及丙酮酸-乳酸平衡紊乱导致的TCA循环加速是其不稳定的核心机制。基于此，研究团队开发了一种代谢优化培养基（MBH），成功实现单倍体的稳定维持。该工作不仅为基于haESC的遗传筛选提供了有效工具，也深化了对哺乳动物细胞中线粒体质量控制（MQC）机制的理解。

　　

在生命科学和医学研究领域，寻找能高效解析基因功能的工具细胞是推动科学发现的关键。单倍体胚胎干细胞（haESC）因其只含有一套基因组，成为了进行遗传筛选和功能研究的理想“单倍体工具箱”。然而，这个工具箱有一个令人头疼的缺陷：在常规培养中，它们会自发地从单倍体状态转变为二倍体状态，这个过程被称为“二倍体化”。一旦发生二倍体化，其遗传学上的优势便荡然无存，严重阻碍了其在更广泛领域的应用。多年来，科学家们虽然尝试了多种方法，如周期性的流式细胞分选或特定基因敲除（如p53）来阻止这一过程，但这些方法要么费时费力，要么会引入不可控的基因组改变。那么，驱动haESC二倍体化的根本原因究竟是什么？是否存在一种更安全、更有效的策略来维持其单倍体状态？这正是发表于《Advanced Science》的这项研究旨在回答的核心问题。

为了深入探索，研究人员运用了多种关键技术与方法。他们通过结合细胞周期和倍体性的流式分选策略，精确分离了单倍体（WT-haESCs）和已二倍体化的细胞（Di-haESCs），为后续的比较研究提供了纯净样本。通过转录组测序（RNA-seq）和靶向中心碳代谢物的液相色谱-串联质谱（LC?MS/MS）分析，他们系统描绘了二倍体化过程中的基因表达和代谢物水平变化。利用MitoTracker染色、透射电子显微镜（TEM）观察、Seahorse细胞能量代谢分析（测量氧消耗率OCR）以及线粒体DNA（mtDNA）定量等技术，他们全面评估了线粒体的数量、形态和功能变化。为了筛选调控此过程的关键基因，研究还采用了基于CRISPR-Cas9的全基因组敲除筛选（使用GeCKOv2文库），并结合流式分选富集线粒体含量异常高的细胞群进行测序分析。最后，通过体外拟胚体分化和体内畸胎瘤形成实验，验证了在优化培养基中培养的细胞的正常多能性和分化潜能。

研究结果

2.1 稳定的haESCs（p53-KO）与WT-haESCs相比表现出较低的代谢活性

通过比较二倍体胚胎干细胞、野生型单倍体干细胞以及敲除了p53基因的稳定单倍体干细胞的转录组和代谢组，研究人员发现，稳定的单倍体状态与整体代谢活性（特别是糖酵解和三羧酸循环相关基因表达及中间产物水平）的降低相关联。这提示，一种全局性减弱的能量代谢状态可能有利于单倍体的维持。

2.2 中心碳代谢的转录组和代谢组在自发二倍体化过程中发生重塑

研究发现，在从WT-haESCs转变为Di-haESCs的过程中，细胞经历了显著的中心碳代谢重塑。与WT-haESCs相比，Di-haESCs中糖酵解、TCA循环和氧化磷酸化相关基因被显著激活，相应的代谢中间产物也发生积累。主成分分析显示，Di-haESCs的代谢状态介于WT-haESCs和二倍体胚胎干细胞之间，表明其正向一个代谢更活跃的状态转变。

2.3 WT-haESCs的线粒体功能在二倍体化后恢复

线粒体功能分析揭示了WT-haESCs与Di-haESCs之间的显著差异。WT-haESCs的线粒体数量较少，形态呈现环状且嵴结构模糊，表明功能受损。而Di-haESCs不仅线粒体数量增加了一倍，形态也变得细长、嵴结构清晰，形成了健康的网状结构。Seahorse能量代谢分析证实，Di-haESCs的基础呼吸、最大呼吸能力和ATP产量均显著高于WT-haESCs，其线粒体功能已恢复到与二倍体胚胎干细胞相当的水平。

2.4 培养诱导的应激促进单倍体向二倍体转变的适应性进化

WT-haESCs表现出更高的细胞凋亡率和对凋亡诱导剂更高的敏感性。进一步研究发现，WT-haESCs每个线粒体所负载的活性氧（ROS）水平显著高于Di-haESCs。这表明，WT-haESCs中线粒体功能受损导致的ROS积累增加了细胞的脆弱性和凋亡易感性。在长期培养中，具有更强活力和压力耐受性的Di-haESCs因此逐渐占据优势，这被视为一种“适应性进化”。

2.5 加速的三羧酸循环驱动显著的二倍体化

研究发现，在Di-haESCs中，乳酸丰度增加而丙酮酸丰度降低，乳酸脱氢酶A（Ldha）的表达上调。基因编辑实验显示，敲除Ldha会加速二倍体化，而敲除Ldhb则无此效应。代谢组学和线粒体功能分析表明，Ldha敲除的细胞表现出与Di-haESCs相似的代谢中间产物积累和线粒体呼吸特征，其线粒体形态和数量也得到了改善。研究认为，Ldha敲除导致细胞内丙酮酸水平升高，扩大了TCA循环的底物池，从而加速了TCA循环，最终驱动了二倍体化。补充外源性丙酮酸可加速WT-haESCs的二倍体化，也验证了这一观点。

2.6 遗传筛选鉴定出调控haESCs二倍体化的线粒体质量控制模块

为了探究线粒体质量控制（MQC）系统在此过程中的作用，研究团队利用CRISPR-Cas9进行了全基因组筛选。他们以线粒体含量为指标，筛选出在二倍体化过程中能维持低线粒体含量（从而可能有利于单倍体稳定）的基因。在候选基因中，Fbxw14和Dapk3的敲除被证实能有效稳定单倍体，且即使细胞发生二倍体化，其线粒体数量仍保持较低水平，形态仍不健康。而Hdac9的敲除则加速了二倍体化，但二倍体化后线粒体形态恢复正常。这些结果确认了MQC在二倍体化过程中的关键作用。

2.7 抑制线粒体丙酮酸摄取可稳定单倍体细胞培养