使用定量保留评估方法对亲水相互作用液相色谱中位置异构体的保留行为和选择性进行评价

《Journal of Chromatography A》：Evaluation of Retention and Selectivity for Positional Isomers in Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography Using a Quantitative Retention Assessment Approach

HILIC色谱法通过定量保留评估方法揭示了羟基苯及二羟基苯甲酸异构体的保留机制：低盐浓度下吸附主导，高盐浓度转为分配主导；二羟基苯甲酸异构体分配机制占优，低盐时静电排斥显著。选择性驱动因素因异构体和固定相电荷而异，吸附影响邻苯二酚/间苯二酚等对映体，分配主导三羟基苯酚等，并验证了实验分配系数可替代传统log P值。

　　

大卫·穆斯卡蒂埃洛（David Muscatiello）| 大卫·克莱纳（David Kleiner）| 郭勇（Yong Guo）

费尔利迪金森大学（Fairleigh Dickinson University）药学与健康科学学院，美国新泽西州弗洛勒姆帕克（Florham Park），帕克大道230号，邮编07932

摘要

亲水相互作用色谱法已被证明能够在极性固定相上分离位置异构体。然而，由于缺乏能够区分HILIC中涉及的不同机制（如分配作用、吸附作用和静电相互作用）的方法，位置异构体分离的详细机制尚未完全明了。此外，由于保留机制不明确，选择性的驱动力也尚未得到研究。在这项研究中，我们应用了定量保留评估方法来评估各种羟基苯和二羟基苯甲酸位置异构体的保留机制和分离情况。研究结果表明，在低醋酸铵浓度下，吸附是羟基苯异构体的主要保留机制；而在高醋酸铵浓度下，分配作用成为主要保留机制。对于二羟基苯甲酸异构体，在本研究中使用的整个醋酸铵浓度范围内，分配作用是主要保留机制，而吸附作用是次要机制。在带正电的固定相上，静电吸引力在低盐浓度下对观察到的保留效应有中等程度的贡献。在带负电的固定相上，当醋酸铵浓度低于10 mM时，静电排斥显著降低了保留效果。通过对保留机制的定量评估，可以确定位置异构体选择性的驱动力。基于机制的评估表明，对于间苯二酚/儿茶酚和邻苯二酚/1,2,4-三羟基苯异构体对，吸附作用是选择性的主要因素；而对于1,2,4-三羟基苯和焦性没食子酸异构体，分配作用是选择性的驱动因素。二羟基苯甲酸异构体的选择性主要由在带负电的两性相上的吸附作用决定；然而，在低醋酸铵浓度下，静电排斥也起着重要作用。此外，公共数据库中这些异构体的log P数据通常基于计算得出，难以用于评估它们的相对极性。本研究中测得的分配系数可能可用于此目的。

引言

许多具有生物医学、制药或环境重要性的化合物都存在位置异构体。这些化合物中关键官能团的不同位置可能会改变其物理化学性质，影响药理活性，并可能影响药物分子的代谢[[1], [2], [3], [4]]。环境污染物的异构形式可能具有不同的毒性或化学和生物反应性，从而影响其在环境中的积累和长期滞留[5,6]。由于结构相似性，位置异构体具有相似的物理化学性质，例如分配系数（如log P）。许多常用数据库（如DrugBank、NIH PubChem）中的异构化合物的log P值通常基于计算得出，因为缺乏实验数据。色谱法常用于这类异构体的分析，尽管其他分析技术（如红外光谱、拉曼光谱、核磁共振和质谱）对特定异构体和应用也可能有效[7]。由于结构上的相似性，异构体的分离具有挑战性。反相液相色谱（RPLC）已被用于分离位置异构体[8]。亲水相互作用液相色谱（HILIC）已大部分取代了正相液相色谱（NPLC）来分离极性异构化合物[9]。环肽和糖肽的位置变体通过HILIC成功分离[10,11]。Field等人比较了RPLC和HILIC中邻位、间位和对位氟芬太尼异构体的分离情况[12]。值得注意的是，这些异构体在RPLC和HILIC中的洗脱顺序相反。此外，一些区域异构体，例如腺苷/维达拉滨、2’-脱氧/3’-脱氧鸟嘌呤、茶碱/茶碱，被包括在Kawachi等人推荐的HILIC选择性测试中（即Ikegami测试）[13]。

羟基苯和羟基苯甲酸根据苯环上羟基的位置有多种位置异构体，并且已经研究了它们在医学中的作用[14,15]。由于结构相似性，这些位置异构体是研究色谱中保留机制和选择性的理想候选物。羟基苯异构体的保留行为已在NPLC和RPLC中进行了研究[16,17]。然而，关于HILIC中羟基苯异构体分离的报道尚无。除了RPLC和胶束液相色谱[[18], [19], [20]]外，HILIC也被用于分离羟基苯甲酸异构体[21,22]。三种单羟基苯甲酸异构体（对位>间位>邻位）在裸硅相和两性相上的洗脱顺序相同。Greco等人研究了流动相中水分含量对羟基苯甲酸异构体保留因子的影响，并尝试将实验数据拟合到不同的保留模型中；然而，分配模型和吸附模型都不适用[21]。HILIC中的保留过程可能同时涉及分配作用和吸附作用。然而，模型拟合方法不适合评估分配作用和吸附作用的相对重要性。此外，尚未有关于HILIC中这些位置异构体选择性的研究。由于选择性本质上依赖于保留机制，因此在不清楚保留机制的情况下无法评估选择性。

已发表的研究仅描述了HILIC中位置异构体的保留行为[21,22]。显然，需要新的方法来详细阐明保留机制，以便识别保留和选择性的驱动力。为此，我们开发了一种定量评估方法来评估HILIC中非离子化和离子化化合物的保留机制[23,24]。这种方法可以确定各种机制（如亲水分配、表面吸附和静电相互作用）的定量贡献，而这些机制 bisher仅进行了定性讨论。定量评估方法基于以下前提：非离子化化合物的观察到的保留因子（k_obs）与相比例（Φ）成线性比例，如方程1所示：$k_{o\mathrm{bs}}=k_{\mathrm{ad}}+K?$ 其中K是分配系数；k_ads代表由表面吸附引起的保留，假设它与相比例无关。由于吸附的水层实际上是固定相，因此相比例定义为吸附水层的体积与流动相体积之比[25]。先前的研究发现，流动相中某些盐（如甲酸铵或醋酸铵）的浓度可以改变吸附水层的体积，从而影响相比例[21,25]。这为在HILIC系统中改变相比例提供了简便的方法。如果建立了观察到的保留因子与相比例之间的线性关系，那么可以通过线性回归（方程1）从< />_obs与Φ图的斜率和截距分别获得分配系数（K）和吸附贡献（k_ads）。对于在带电固定相上的离子化分析物，保留受静电相互作用的影响，这可以通过流动相中的盐浓度来调节[26]。当盐浓度足够高时，静电效应对保留的影响可以忽略不计。进一步增加盐浓度时，观察到的保留因子会再次随相比例线性增加，遵循方程1。因此，可以从与Φ图的线性段的斜率确定离子化化合物的分配系数；截距提供了表面吸附的保留贡献（k_ads）。由于分配系数和表面吸附不受盐浓度显著影响，包括吸引和排斥在内的静电相互作用（k_elec）的效应可以通过减法量化：$k_{\mathrm{el}\mathrm{ec}}=k_{o\mathrm{bs}}?(k_{\mathrm{ad}}+K?$ 这里，正的k_elec值表示静电吸引，负的k_elec值表示静电排斥。有关此方法的更多细节，请参见已发表的研究[23,24]。定量评估方法已应用于Ikegami选择性测试中使用的区域异构体的保留机制和选择性的评估[27]。

• 本研究调查了HILIC中羟基苯和羟基苯甲酸位置异构体的分离情况。这些异构体的结构多样性使它们成为选择性研究的理想测试化合物。二羟基苯和三羟基苯异构体在HILIC中的研究尚不充分。尽管之前已经研究过二羟基苯甲酸异构体，但其保留机制尚未明确。本研究的主要目的是使用定量评估方法阐明这些位置异构体的保留机制，并对HILIC中的选择性建立机制理解。更好地理解这些位置异构体的保留机制和选择性不仅可以推进我们在HILIC领域的知识，还可以为其他类型位置异构体的分离提供有意义的指导。其次，本研究旨在证明定量评估方法可用于生成位置异构体的实验测量分配系数，这些异构体的log P值可能无法获得或仅基于计算。因此，通过定量评估方法确定的分配系数可以填补log P值的空白，并用作评估位置异构体相对极性的替代方法。

实验部分

Syncronis HILIC柱（粒径3.0 μm，内径150 × 4.6 mm）由ThermoFisher Scientific（马萨诸塞州沃尔瑟姆）提供。Raptor Polar X柱（粒径2.7 μm，内径100 × 2.1 mm）通过RASP资助由Restek（宾夕法尼亚州贝尔丰特）提供。HPLC级水和乙腈由Fischer Scientific（新泽西州布里奇沃特）提供。醋酸铵由TCI（俄勒冈州波特兰）提供。通过溶解适量的醋酸铵，制备了400 mM的醋酸铵储备溶液。

保留行为

根据已发表的log P值，二羟基苯异构体（儿茶酚、间苯二酚和氢醌）相对疏水，在本研究中使用的含有醋酸铵的流动相中不会电离。因此，选择了含有磺丁胺基两性相的Syncronis HILIC，因为据报道两性相在HILIC中提供更强的保留效果[21]。在含有88%（v/v）乙腈的流动相中，二羟基苯异构体的保留效果很弱

结论

本研究应用了定量评估方法来评估HILIC中羟基苯和二羟基苯甲酸异构体的保留机制和选择性。这是首次详细描述这些异构体的保留机制和选择性驱动力的报告。尽管二羟基苯异构体相对疏水，在较高乙腈浓度下保留效果较弱，但随着相比例的增加，保留因子显著增加

CRediT作者贡献声明

大卫·穆斯卡蒂埃洛（David Muscatiello）：撰写 – 审稿与编辑、研究、数据管理。大卫·克莱纳（David Kleiner）：撰写 – 审稿与编辑、研究、数据管理。郭勇（Yong Guo）：监督、方法论、资金获取、正式分析、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本项目得到了美国国家科学基金会（Grant ID：2402756）的研究资助。作者感谢Restek通过RSAP资助提供了实验所需的柱子。