《Journal of Chromatography B》：Development and validation of a high-throughput LC-MS/MS method for simultaneous quantification of Lyso-GL1 and Lyso-GL3 in dried blood spots for rare disease screening
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开发并验证了一种高通量液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），可同时定量分析干血斑（DBS）中的神经鞘脂糖苷 Lyso-GL1 和 Lyso-GL3，实现 Gaucher 病和 Fabry 病的早期筛查。方法采用甲醇-水溶剂及同位素内标，简化了传统固相萃取等复杂预处理步骤（耗时减少60%，溶剂消耗降低83%），优化温度（45℃）、转速（1300rpm）和提取时间（1.5h），确保回收率85%-115%，灵敏度达0.5-0.8ng/mL，线性范围宽（R2均>0.99），临床验证显示方法稳定性良好。
张晓芬|朱婉婉|王彦敏|季伟|郭静|周卓|姜娟|田国利
中国上海交通大学医学院附属上海儿童医院新生儿筛查中心
摘要
本研究开发并验证了一种高通量液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，用于同时定量干血斑（DBS）中的葡萄糖基鞘氨醇（Lyso-GL1）和Lyso-GL3。目标分析物使用含同位素内标的甲醇-水溶液从DBS中提取并进行定量。色谱分离在C18柱（2.1 × 50 mm，1.7 μm）上进行，温度为50°C，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液，采用梯度洗脱（0.4 mL/min）。通过优化提取条件（45°C，1300 rpm，1.5 h）以提高回收率，该方法是一种简化的一步提取方案，取代了繁琐的传统预处理方法（如固相萃取）。方法验证包括线性、精度、灵敏度以及使用20个DBS样本的临床验证。Lyso-GL1和Lyso-GL3的定量限（LOQ）分别为0.5 ng/mL和0.8 ng/mL（信噪比≥10）。线性范围分别为Lyso-GL1的2.716–51.088 ng/mL（R2=0.9997）和Lyso-GL3的2.416–49.846 ng/mL（R2=0.9991），回收率为85%–115%，批内/批间精密度CV<15%，灵敏度可低至0.5 ng/mL。临床验证表明该方法具有良好的稳定性。这是首次应用DBS技术同时检测Lyso-GL1（戈谢病生物标志物）和Lyso-GL3（法布里病生物标志物）的方法，具有简化样品预处理的优势，能够实现戈谢病和法布里病的高通量筛查，充分利用了干血斑在罕见病筛查中的稳定性和便利性。
引言
戈谢病（GD）是一种常染色体隐性溶酶体贮积症，由GBA1基因突变引起，导致β-葡萄糖脑苷脂酶活性受损，进而使葡萄糖基神经酰胺和葡萄糖基鞘氨醇（Lyso-GL1）在体内积累。这些底物的血清浓度升高会导致多器官功能障碍（如肝脏、脾脏、骨骼、肺和大脑），尤其在儿童患者中更为严重。早期筛查和诊断对于改善治疗结果和预后至关重要。Lyso-GL1作为戈谢病的潜在生物标志物，因其高灵敏度和特异性而被广泛用于辅助诊断和随访监测[1]、[2]。法布里病是一种X连锁遗传性疾病，由α-半乳糖苷酶A（α-gal A）活性缺陷引起，导致globotriaosylceramide（Lyso-GL3）及其脱乙酰衍生物Lyso-GL3在体内积累，从而引发多器官损伤[2]、[3]。与GL3相比，Lyso-GL3具有更好的分析性能，包括在体液中的更高溶解度和稳定性，使其成为临床检测的更有前景的目标[4]、[5]、[6]。目前检测Lyso-GL1和Lyso-GL3的方法主要限于单一分析[7]、[8]、[9]。跨多个临床样本同时定量这两种生物标志物需要重复实验，增加了操作复杂性、周转时间，并不适用于常规临床实践。
传统的样本基质（如血浆、血清或全血）存在显著局限性[10]：需要大量样本；额外的处理步骤（如血浆/血清分离）繁琐；液体样本容易因光照、pH值和酶降解而不稳定；冷链运输在偏远地区会增加成本；还存在生物危害风险（如病原体暴露）。精确的体积测量也是避免定量不准确性的关键。干血斑（DBS）技术涉及将全血滴在滤纸上，风干形成血斑，然后通过溶剂提取进行分析（如荧光或串联质谱）[11]。与传统血液采集方法相比，DBS具有简单、所需血液量少以及易于储存/运输的优点[12]。本研究首次应用DBS技术检测Lyso-GL1和Lyso-GL3，并首次实现了使用DBS技术同时定量这两种生物标志物，解决了现有单一分析方法的关键限制。
传统的预处理方法，如固相萃取（SPE）和多步液-液萃取，涉及繁琐的程序（涡旋、振荡、超声处理、离心、氮气蒸发、复溶和SPE过滤），消耗大量有机溶剂，并存在环境问题[13]、[14]。相比之下，本研究建立了一种简化的一步甲醇-水提取方案（45°C，1300 rpm，1.5 h），替代了这些繁琐的步骤，确保了高回收率（85%–115%），为高通量筛查奠定了基础。因此，样本基质选择和多分析物检测仍 merupakan主要的技术挑战。
本研究旨在建立一种液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，用于同时高通量检测Lyso-GL1和Lyso-GL3。通过采用一步甲醇提取（1.5 h），优化血细胞比容（HCT=45%–50%），并选择低内源性小鼠全血作为替代基质以最小化基质效应，以及开发同位素内标算法以消除重复校准，该方法显示出显著的临床实用性。此外，该方法实现了较低的LOQ（Lyso-GL1为0.5 ng/mL，Lyso-GL3为0.8 ng/mL，信噪比≥10）和宽线性范围，优于大多数现有的单一分析方法，更适合罕见病的早期临床筛查。
材料
仪器：ACQUITY UPLC/Xevo TQ-S三重四极杆串联质谱系统（Waters Corporation，美国），配备电喷雾离子化（ESI）源；WKB-100-4微孔板振荡器（上海晶鑫）；Eppendorf电子移液器。
试剂：Lyso-GL1、Lyso-GL3及同位素标记的内标（纯度>98%，ChemBind）；LC-MS级甲醇和乙腈（CNW；纯度99.9%）；S&S 903滤纸（GE Healthcare）；超纯水（18.2 MΩ·cm）；国际标准S&S903
样本预处理条件的优化
在本研究中，优化样本预处理条件是确保从干血斑中有效提取鞘脂（Lyso GLs）的关键步骤。通过系统地优化各种提取溶剂和条件（补充材料表S1），我们评估了不同条件下的提取回收率（补充材料表S2），以确定最佳预处理方案。
在优化过程中，共进行了16次不同的
讨论
本研究开发并验证了一种高通量LC-MS/MS方法，用于同时定量干血斑中的Lyso-GL1和Lyso-GL3，充分利用了DBS在罕见病筛查中的稳定性和便利性。该方法低有机溶剂消耗和简化的样本预处理使其环保且适用于大规模筛查[17]。与传统方法相比，该方法减少了83%的溶剂使用量，并将预处理时间缩短了60%
结论
总之，本研究成功建立了一种LC-MS/MS方法，用于在DBS中同时高通量检测Lyso-GL1和Lyso-GL3。该方法表现出比现有技术更高的灵敏度、环保性和操作便利性[23]。尽管该方法表现出良好的性能，但仍需通过更大规模的患者群体和不同人群进行进一步验证，以确保其更广泛的适用性。此外，还需要进一步研究其稳定性
CRediT作者贡献声明
张晓芬：撰写初稿、争取资金、数据管理。朱婉婉：撰写、审稿与编辑、验证、项目管理、数据分析。王彦敏：监督、方法学设计、数据管理。季伟：监督、项目管理、研究设计、概念构思。郭静：验证、方法学设计、数据分析。周卓：软件开发、方法学设计、研究设计、数据分析。姜娟：监督、资源协调、项目管理、研究设计
资助
本工作得到了上海市科学技术委员会“科技创新行动计划”医学创新研究项目（22Y11906900）、上海儿童医院临床研究培养计划（2023YLY06）、上海交通大学跨学科计划（YG2022QN097）以及上海市儿童医院国家自然科学基金培养计划（2021YGZQ09）的支持
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报道工作的竞争性财务利益或个人关系。
