Cas12a的桥螺旋结构中的螺旋度（helicity）调控着其对目标DNA的切割效率以及对非目标DNA的切割倾向

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Helicity of the bridge helix of Cas12a regulates on-target DNA cleavage efficiency and off-target cleavage propensity

CRISPR-Cas12a的桥接螺旋（BH）通过脯氨酸/丙氨酸替换调控螺旋稳定性，影响DNA切割效率与错配识别特异性。丙氨酸替换增强BH稳定性，提高靶向切割效率但降低错配检测能力；脯氨酸替换则降低切割效率但增强对错配的敏感性。该研究为优化Cas12a基因编辑工具的特异性提供了新策略，其机制与Cas9类似，但通过氨基酸替换实现了螺旋稳定性的精细调控。

　　

Lindsie Martin|Saadi Rostami|Isabelle Schuster|Peter Z. Qin|Rakhi Rajan

俄克拉荷马大学化学与生物化学系，Price Family基金会结构生物学研究所，Stephenson生命科学研究中心，101 Stephenson Parkway，Norman，OK，73019，美国

摘要

CRISPR-Cas系统包含一种由CRISPR RNA（crRNA）引导的CRISPR相关（Cas）核酸酶，用于提供免疫保护。crRNA与入侵基因组之间的互补碱基配对会形成“R-loop”，从而触发Cas蛋白的核酸酶活性，有效中和入侵。这种分子机制已被重新用于基因组应用，主要使用Cas9和Cas12a。Cas12a具有多个优势特性，包括体积较小、能够处理crRNA以及能够产生阶梯状的双链DNA（dsDNA）切割。然而，使用这些Cas蛋白进行基因编辑时存在一些问题，如脱靶和非特异性DNA切割。为了提高DNA切割的特异性，我们在Cas12a中保守的精氨酸/赖氨酸富集“桥螺旋”（BH）的不同位置引入了脯氨酸/丙氨酸替换，该结构在介导DNA切割所需的构象变化中起着关键作用。切割动力学分析表明，通过丙氨酸替换增强Francisella novicida Cas12a的BH螺旋完整性可以提高DNA切割效率，同时降低其区分DNA错配的能力。脯氨酸替换则产生了相反的效果，降低了切割目标DNA的效率，但几乎完全消除了R-loop中间有错配时的线性化现象。这些结果与Cas9的研究结果一致，表明通过合理的氨基酸替换来平衡BH的螺旋性可以精细调节Cas12a的脱靶行为。这可能为提高Cas12a在基因组操作中的特异性提供一种策略。

部分摘录

引言

在过去十年中，由于CRISPR-Cas系统具有通过crRNA介导的DNA靶向和双链DNA（dsDNA）切割能力，它们已被重新用作强大的基因编辑工具[1]、[2]。Cas蛋白Cas9和Cas12a因其作为单效应核酸酶的特性而被广泛用作基因编辑器和医学诊断工具，因为它们可以通过CRISPR-RNA（crRNA）序列轻松编程以靶向特定DNA序列[1]、[3]、[4]、[5]。虽然Cas9是

FnoCas12a变体的构建与纯化

野生型（WT）fnocas12a基因被克隆到带有N端8X组氨酸标签和麦芽糖结合蛋白（MBP）标签的pET28m载体中[26]，而FnoCas12a^KD2P变体[22]则是在之前的研究中创建的。野生型质粒骨架被用作定向突变（SDM）的模板，以引入K969A/D970A、E961A/K962A和E961P/K962P替换，分别生成新的变体FnoCas12a^KD2A、FnoCas12a^EK2A和FnoCas12a^EK2P（表S1）。FnoCas12a^WT

分析Cas12a BH不同位置的侧链相互作用与螺旋性的功能作用

研究表明，Cas9和Cas12a中保守的精氨酸/赖氨酸富集BH在结合核酸时会发生构象变化[15]、[22]、[30]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35]。干扰这些构象变化会减慢目标切割速度，但可以提高对DNA错配的敏感性[22]、[23]、[24]、[29]、[31]、[36]。在我们之前的研究中，FnoCas12a^KD2P变体（K969P/D970P）显示出更高的特异性，这体现在其更倾向于进行切割

BH不同位置的螺旋性对高效DNA切割的影响

在这项工作中，我们的目标是比较脯氨酸（一种螺旋破坏剂）与丙氨酸（具有较高的α-螺旋倾向）在Cas12a BH不同位置对DNA切割的促进作用。我们测试了它们对特异性（RNA引导的DNA切割）和非特异性（trans和R-I）DNA切割的影响。我们感兴趣的是评估BH的稳定性（由链内H键调控）以及氨基酸侧链对整体切割效率的贡献

结论

保持BH螺旋性的适当平衡对Cas12a的活性至关重要。螺旋性过低会阻碍其协调两个叶片的运动，从而无法完成达到催化活性形式所需的构象变化；而螺旋性过高则会使蛋白质在DNA切割过程中过于高效，以至于无法评估crRNA引导区域与DNA之间的序列互补性，从而无法激活切割复合物。

CRediT作者贡献声明

Isabelle Schuster：撰写 – 审稿与编辑，形式分析。Saadi Rostami：撰写 – 审稿与编辑，数据管理。Lindsie Martin：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，形式分析，数据管理。Peter Z Qin：撰写 – 审稿与编辑，验证，监督，资金获取，形式分析，数据管理。Rakhi Rajan：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，验证，监督，资源协调，项目管理，资金获取，形式分析

利益冲突声明

目前有两项关于FnoCas12a BH的美国专利（US11459552B2和US12163166B2）。除此之外，作者声明没有其他利益冲突。

资助

本研究部分得到了以下机构的资助：国家科学基金会 [MCB-2424888]（授予R.R.）、俄克拉荷马州科学技术促进中心（OCAST，HR20–103，授予R.R.）、俄克拉荷马大学诺曼校区研究委员会（授予R.R.）、美国国立卫生研究院（R35-GM145341，授予P.Z.Q.）以及Dodge家族文理学院的论文完成奖学金（授予L.M.）。

利益冲突声明

?作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：目前有两项关于FnoCas12a BH的美国专利（US11459552B2和US12163166B2）。除此之外，作者声明没有其他利益冲突。

致谢

我们感谢OU蛋白质生产与表征核心设施（PPCC）提供的蛋白质纯化服务和仪器支持。OU PPCC得到了NIGMS的IDeA资助[资助编号：P20GM103640和P30GM145423。