基于偏振依赖二次谐波成像的胶原纤维三维取向高通量定量测绘新方法

《Acta Biomaterialia》：A quantitative approach for high-throughput mapping of collagen fibril orientation using polarization-dependent Second Harmonic Generation

为破解骨组织矿化胶原纤维（MCFs）三维取向难以高分辨率、高通量绘制的难题，研究人员提出了一种定量偏振依赖二次谐波（qPSHG）成像新框架。该工作通过理论建模与实验验证，实现了对胶原纤维三维取向（包括面内角δ与面外角θ）的亚微米级、快速定量映射，在人类皮质骨中成功解析了骨单位内层状结构的周期性排列。该方法为建立骨超微结构与力学性能、疾病相关的定量关联提供了强有力工具。

　　

骨骼之所以能承受巨大的机械负荷，其奥秘很大程度上蕴藏在纳米尺度的精巧构造之中。骨骼的基本“砖块”是直径约100纳米的矿化胶原纤维（MCFs）。这些纤维并非杂乱无章，而是以一种高度有序的方式排列，形成一种被称为“层状”的结构，层层堆叠构成骨单位。这种纳米级的纤维排列方向，即胶原纤维的三维取向，是决定骨骼强度、韧性等关键力学性能的核心因素。然而，如何快速、精确且大范围地描绘出这些微小纤维在三维空间中的指向，一直是科学家们面临的巨大挑战。传统技术如同步辐射X射线断层扫描，虽能提供关键信息，但依赖大型科学装置，难以常规化应用；而电子显微镜等技术则样本制备复杂，且难以实现大范围的高分辨率测绘。这限制了我们深入理解骨骼结构与功能的关系，也阻碍了对骨质疏松症、成骨不全症等骨骼脆性疾病的超微结构根源的探索。

为了破解这一难题，一支由Valeria Zanrè、David Nguyen、Tatiana Kochetkova、Justine Kusch-Wieser、Marianna Gerina、Bruno F.B. Silva、Philippe Zysset和Jakob Schwiedrzik组成的研究团队，开展了一项创新性研究。他们开发并验证了一种名为“定量偏振依赖二次谐波成像”的新方法。二次谐波成像是一种无需标记的成像技术，能特异性地“点亮”胶原蛋白。当结合偏振光技术时，信号的强弱会随入射激光偏振方向的变化而变化，而这种变化模式蕴含着胶原纤维取向的“密码”。本研究的关键在于，研究人员不仅利用了这种信号变化，还通过精密的物理建模，从中定量解码出了胶原纤维在三维空间中的精确指向——包括其在成像平面内的角度（δ）和相对于成像平面倾斜的角度（θ）。相关研究成果已正式发表于材料科学领域的知名期刊《Acta Biomaterialia》。

为了验证并应用这一qPSHG方法，研究团队综合运用了多项关键技术。首先，他们以火鸡腿矿化肌腱（MTLT）这一胶原纤维高度单向排列的简化模型系统为校准样本，利用偏振依赖二次谐波成像结合理论模型拟合，提取了表征胶原非线性光学性质的关键参数——二阶非线性极化率张量分量比d₃₃/d₃₁。其次，他们通过小角X射线散射（SAXS）独立、精确地测量了多个已知倾斜角度的MTLT样本中胶原纤维的整体平均取向，作为验证qPSHG方法准确性的“金标准”。然后，研究人员基于C_6v对称性假设，推导了包含纤维面外倾斜角（θ）影响的二次谐波信号强度理论公式，并通过约束拟合参数间的关系，构建了稳定、可求解的qPSHG分析模型。最后，他们将校准后的qPSHG方法应用于来源于髋关节置换手术患者（伦理批准号：13/05/2020，临床试验注册号：NCT04787679）的人类皮质骨样本，实现了对骨单位内胶原纤维三维取向的高分辨率、高通量空间映射。

4.1. 从横向MTLT样本中提取d₃₃/d₃₁比值

研究人员对已知面外倾角接近0°（0.7°）的MTLT样本进行P-SHG测量。通过将每个像素点的信号强度随偏振角变化的曲线拟合至经典理论模型，成功提取了胶原纤维的平均面内取向角δ和关键的d₃₃/d₃₁比值。结果显示，拟合得到的d₃₃/d₃₁比值为1.42 ± 0.08，与文献中报道的胶原组织值范围一致，验证了校准的可靠性。

4.2. qPSHG理论预测及在不同面外角度θ的MTLT样本上的验证

利用从横向样本获得的平均d₃₃/d₃₁比值，研究人员建立了拟合参数C₁、C₂与纤维面外倾斜角θ之间的理论关系，并约束了C₁= -0.163 C₂²，从而构建了只依赖于单个参数C₂的qPSHG模型。随后，他们对一系列已知不同θ角度（通过SAXS测量）的MTLT样本进行了P-SHG成像，并用新模型进行拟合，得到实验C₂值的分布。通过非参数小波密度估计获得分布的峰值位置，并将其转换为θ估计值。结果显示，qPSHG预测的θ值与SAXS测量的参考值高度吻合，均方根误差为6.9°，一致性相关系数高达0.97，成功验证了qPSHG方法定量提取三维取向的准确性。灵敏度分析进一步表明，在实验测得的d₃₃/d₃₁比值波动范围内，θ的重建结果稳健。

4.3. 使用qPSHG绘制人类骨单位的层状结构图

将经过验证的qPSHG方法应用于人类皮质骨样本。在大约110微米×110微米的视野内，仅用时约7.5分钟便获得了亚微米分辨率（0.65微米/像素）的胶原纤维三维取向图。定量取向图清晰揭示了次级骨单位内典型的同心圆层状结构。远离哈弗斯管的纤维（θ角较小）主要呈圆周方向排列，而靠近管腔的纤维则表现出更大的面外倾斜。通过从哈弗斯管边界沿径向提取取向剖面并进行傅里叶变换分析，研究人员量化了面外取向沿径向的周期性波动。中值功率谱显示出一个主导空间频率，对应的层状结构空间周期性约为6.2微米，与已知的骨板厚度范围一致。对同一标本中另一个骨单位的重复分析得到了相似的结果（6.3微米），证明了方法的可重复性。

4.5. θ重建对校准d₃₃/d₃₁比值不确定性的敏感性与4.6. qPSHG θ取向测绘的重复性

为评估方法的稳健性，研究进行了两项关键分析。首先，他们测试了使用d₃₃/d₃₁比值的平均值及其正负标准差进行θ重建时结果的差异。在所有验证样本中，由此引起的θ值变化中位数均小于或接近于qPSHG方法本身6.9°的固有不确定度，表明校准参数的小幅波动对最终取向提取结果影响有限。其次，他们对同一个骨单位进行了连续两次独立的图像采集和qPSHG分析。两次重建的θ图在像素水平上的均方根误差仅为2.5°，远低于方法固有误差，且一致性相关系数达0.96，证明了该方法在真实生物样本中具有出色的测量重复性。

本研究成功开发并验证了一种全新的定量偏振依赖二次谐波成像框架。该方法的核心贡献在于，通过理论创新和模型约束，首次实现了基于常规激光扫描显微镜，对矿化胶原纤维三维取向进行快速、高通量、高分辨率的定量空间测绘。研究首先利用结构简单的矿化火鸡腿肌腱模型，精确校准了关键的非线性光学参数d₃₃/d₃₁。随后，通过在已知倾角的模型样本上进行系统验证，证实了该方法能够准确提取胶原纤维的面外倾斜角，精度在可接受范围内。最终，将该技术应用于复杂的人类皮质骨组织，成功以亚微米分辨率解析了骨单位内胶原纤维的层状排列模式，并定量测量了其周期性。

这项研究的重大意义在于，它打破了传统技术在高分辨率、大范围测绘骨超微结构三维取向方面的瓶颈。qPSHG方法将高空间分辨率与快速成像速度相结合，使其非常适合于需要大规模分析的研究，例如探索骨骼的解剖学差异、年龄相关变化以及病理状况（如骨质疏松症、成骨不全症、Paget‘s病）对纤维组织结构的影响。通过提供胶原纤维三维取向这一能够与局部微观力学性能直接关联的关键结构参数，该方法为建立更精确的“结构-性能”关系模型、理解骨骼的力学行为以及开发用于评估骨质量和脆性的新型定量生物标志物，提供了一个强大而实用的新工具。此外，该qPSHG框架的原理具有普适性，未来或可推广应用于探测其他基于胶原的生物材料和工程材料的三维超微结构。