端粒酶驱动的双端扩增技术用于端粒酶活性的高灵敏度电化学生物传感

《Biosensors and Bioelectronics》：Telomerase-driven dual-end amplification for sensitive electrochemical biosensing of telomerase activity

本研究开发了一种基于金纳米棒与有序多孔碳的电化学生物传感器，通过TdT介导的信号放大策略，实现端粒酶活性的高灵敏检测，为癌症早期诊断提供新方法。

　　

徐龙耀|林浩|陈美玉|张嘉荣|张玉凡

中国河北省分析科学技术重点实验室，教育部药用化学与分子诊断重点实验室，河北大学化学与材料科学学院，保定市，071002

摘要

准确评估和可靠量化癌细胞中的端粒酶活性对于早期癌症诊断和治疗至关重要。在这项工作中，我们开发了一种基于单分散金纳米棒（Au NRs）和有序介孔碳（OMC）对对乙酰氨基酚（AP）的电催化信号放大的电化学方法来实现端粒酶的检测。通过引入双脱氧胞苷实现信号切换，而钴离子则调节序列延伸，从而能够有效地将标记有Au NR的信号探针固定在电极表面。所提出的生物传感器表现出优异的稳定性、特异性和重复性，显示出其在体外癌症检测中的强大潜力。这一策略可能有助于推进早期癌症筛查技术的发展。然而，临床转化仍面临挑战，包括真实生物样本的复杂性以及需要标准化的大规模生产。解决这些限制对于下一代生物传感平台的发展至关重要。

引言

在半保留DNA复制过程中，滞后链的合成不可避免地伴随着末端核苷酸片段的丢失。位于染色体末端的端粒作为保护结构，能够维持基因组的完整性。然而，端粒会随着细胞分裂的进行而逐渐缩短。端粒酶是一种核糖核蛋白酶，负责染色体末端的修复，它可以通过使用其内在的RNA模板添加(TTAGGG)_n重复序列来延长缩短的滞后链，从而补偿复制引起的端粒磨损（El Ma?等人，2023年；Liu等人，2024年；Yin等人，2024年）。端粒酶在细胞增殖和分化中起着关键作用。它在干细胞和超过85%的癌细胞中高表达（Jayaprasad等人，2024年；Liu等人，2022年；Shay和Wright，2019年），而在大多数分化的体细胞（包括免疫细胞、腺细胞和组织细胞）中，其活性极低或无法检测到。因此，快速且敏感地检测端粒酶活性对于早期癌症诊断和治疗监测具有重要意义（He等人，2021年；Wan等人，2021年；Zhang等人，2024a，2024b）。

目前，已经开发了多种用于端粒酶检测的分析技术（Mahato等人，2018年；Prasad等人，2016年；Ranjan Srivastava等人，2023年；Azad和Chandra，2025年）。例如，Wang等人报道了一种基于适配体-脂质体的端粒酶激活树突纳米组装策略，用于高保真度地可视化端粒酶活性（Wang等人，2024年），而Dai等人开发了一种基于距离依赖性信号调制的端粒酶响应磁共振成像探针，用于体内分析（Dai等人，2023年）。尽管取得了这些进展，但这些方法通常涉及复杂的样品预处理，并需要复杂且昂贵的仪器。相比之下，电化学方法具有明显的优势，包括低成本、操作简便性和高灵敏度（Dai等人，2025年；Gou等人，2025年；Yan等人，2025年）。然而，由于端粒酶及其延伸产物本身不具有氧化还原活性，电化学检测通常依赖于间接的信号标记策略（Chen等人，2025年；Shi等人，2021年）。

末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）是DNA聚合酶X家族中的一种58 kDa的成员，与聚合酶λ和聚合酶μ等一起参与DNA修复。TdT是一种模板独立的DNA聚合酶，能够催化将脱氧核苷酸添加到单链DNA的3′-羟基末端。与其他DNA聚合酶一样，TdT需要二价金属离子来促进核苷酸掺入过程中的磷酸转移反应。值得注意的是，在Co²⁺存在下，TdT优先掺入嘧啶脱氧核苷酸，其效率大约是嘌呤核苷酸的十倍（Ashley等人，2022年；Schneider等人，2023年）。由于这些独特的生化特性，TdT在分子生物学和生物传感应用中得到了越来越多的应用。

在这项研究中，我们利用TdT的模板独立聚合能力开发了一种用于检测端粒酶活性的电化学生物传感器。金纳米棒（Au NRs）具有优异的导电性和电催化活性，而经过酸处理的有序介孔碳（OMC）提供了丰富的表面羧基用于探针固定。具体来说，cDNA通过其氨基与OMC的羧基之间的酰胺偶联固定在OMC修饰的电极上。这项工作的核心创新在于一种TdT介导的二级放大策略。在端粒酶提取物和dNTPs的存在下，端粒酶底物引物（TS）被延长形成(TTAGGG)_n重复序列，这些序列与固定的cDNA杂交。随后TdT延伸TS和扩增链S2的3′末端，生成产生信号的序列。在Co²⁺离子的调控下，TdT优先掺入胸苷残基，促进与Au NR功能化信号探针（S1）的有效杂交。在没有端粒酶的情况下，cDNA的3′末端被双脱氧胞苷（ddC）阻断，有效防止TdT介导的延伸和非特异性扩增。分析信号来源于对乙酰氨基酚（AP）的电催化氧化，这一过程在Au NRs的作用下显著增强，从而实现敏感的电化学检测。生物传感器的示意图见图1。总体而言，这一策略提供了一个稳健且敏感的平台，具有在体外癌症检测中的巨大潜力。

实验部分

所有实验操作都在“补充材料”中有详细说明。

催化剂材料的表征

OMC和Au NRs的形态通过扫描电子显微镜（SEM）和高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）进行了表征。如图1A所示，Au NRs的晶格条纹显示出0.235 nm的层间间距，对应于(111)晶面。TEM图像（图1C）显示了平均长度约为30 nm、宽度约为8 nm的均匀棒状Au NRs。能量分散光谱（EDS）元素映射（图1D）进一步证实了

结论

总之，我们开发了一种基于Au NRs纳米探针催化的对AP信号放大的新型电化学生物传感器，用于敏感且可靠地检测端粒酶活性。使用HeLa细胞作为模型系统，直接监测了电催化响应的剂量依赖性变化，证实了所提出平台的可行性。关键实验参数包括TS引物、Au NRs、TdT和cDNA的浓度和孵育时间

CRediT作者贡献声明

徐龙耀：数据管理、正式分析、研究、方法学、软件、撰写——初稿。林浩：数据管理、正式分析、研究、方法学、软件、撰写——初稿。陈美玉：正式分析、研究、方法学、软件、验证、撰写——初稿。张嘉荣：数据管理、正式分析、研究、资源、软件、撰写——初稿。张玉凡：概念构思、数据管理、正式分析、资金支持

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了河北省分析科学技术重点实验室（编号：22567620H）和河北大学的跨学科研究计划（DXK202406）的支持。