《Bioresource Technology》：De novo production of sebacic acid from glucose by Saccharomyces cerevisiae via engineered ω-oxidation and β-oxidation pathways
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癸二酸生物合成：通过CRISPR-Cas9敲除酿酒酵母6个脂肪酸降解基因，构建菌株6KO高效积累癸酸（28.9 mg/L）。整合热带假丝酵母ω-氧化途径基因（CYP52B1、NCP1、ADH1、ALD1），采用多拷贝扩增和GAL1诱导表达，使SA产量提升至38.8 mg/L，创工程酵母直接利用葡萄糖生产SA的最高记录。
王帅文|吴玉英|池尚允|尹恩珠|金庆宪
韩国大学研究生院生物技术系，首尔02841，大韩民国
摘要
癸酸（SA）是一种重要的工业化合物，用于生产生物基聚酰胺、增塑剂、润滑剂和化妆品成分，传统上是从蓖麻油中提取的。在这项研究中，我们利用CRISPR-Cas9技术在酿酒酵母中开发了一种代谢工程策略，实现了从葡萄糖从头合成SA。通过删除六个脂肪酸降解基因（FAA1、FAA4、POX1、PEX11、PXA1和FAA2），获得了6KO菌株，该菌株能够从20克/升的葡萄糖中积累28.9毫克的癸酸（DA），而葡萄糖是SA的关键前体。将Candida tropicalis MYA-3404中的四个ω-氧化基因（CtCYP52B1、CtNCP1、CtADH1和CtALD1）整合到基因组中后，初始SA产量达到了0.4毫克/升。由于ω-碳氧化是限速步骤，通过Ty1逆转录转座子将CtCYP52B1和CtNCP1多拷贝整合到酵母基因组中，SA产量显著提高至14.9毫克/升。进一步通过应用可诱导的GAL1启动子并删除转录抑制因子GAL80，SA产量提高到了16.2毫克/升。最终，结合多拷贝整合和GAL1诱导，得到了一个能够从葡萄糖直接生成38.8毫克/升SA的菌株——这是迄今为止报道的最高产量。这些结果证明了通过整合代谢途径、基因扩增和可诱导控制，使酵母成为可持续合成SA的可行平台。
引言
癸酸（SA）是一种高价值的饱和二羧酸（C10H18O4），含有两个末端羧基。2024年全球SA市场价值为2.863亿美元，预计到2034年将达到3.737亿美元，复合年增长率（CAGR）为3%（Reporter Metric，2024年）。由于其多功能结构，SA被广泛用作尼龙生产的单体以及增塑剂、润滑剂和化妆品添加剂（Jeon等人，2019年）。
蓖麻（Ricinus communis）油仍然是工业生产SA的主要可再生原料（Veli?kovi?等人，2025年）。然而，其种植和加工存在重大的可持续性和安全性问题。全球供应高度集中，印度占产量的50%以上，导致市场不稳定（Logan和Udeshi，2002年）。在中国，尽管需求不断增长，但由于种植面积减少和劳动力短缺，产量受到限制。此外，蓖麻种子含有蓖麻碱和蓖麻毒素等有毒蛋白质，处理时存在风险。传统的碱性融合工艺使用浓氢氧化钠和苯酚在230–290°C下进行，但产率低（约50%重量百分比），腐蚀严重，并产生大量含苯酚的废水（Avramovic等人，2025年）。还需要复杂的下游纯化步骤来回收副产品，如2-辛醇和癸酸（DA）。这些缺点凸显了需要更安全和更可持续的替代方案。
在全球追求碳中和的背景下，生物转化途径已成为有前景的替代方案。二倍体酵母如Candida tropicalis具有天然的ω-氧化途径，能够以接近完全的分子效率和最小的副产物将烷烃或脂肪酸甲酯转化为SA。然而，C. tropicalis并不被普遍认为是安全的（GRAS）生物，其大规模使用存在生物安全问题。此外，其二倍体基因组和有限的遗传工具限制了代谢工程的应用（Pham等人，2023年；Zhang等人，2021年）。这些限制凸显了需要更安全且遗传操作性更好的宿主。
酿酒酵母是一种长期被驯化的酵母，用于酿造和烘焙，由于其遗传特性明确、强大的基因编辑系统以及良好的大规模安全性记录，是理想的工业宿主。它已被成功用于生产多种高价值化学品和天然产物（Zhu等人，2020年）。来自第一代和第二代生物质的丰富糖流使其特别适合可持续生物制造。其中，葡萄糖是最容易获得的底物，质量稳定，并且与标准批次系统兼容。
建立一条从头合成途径需要从葡萄糖高效内源性生成癸酸（DA）。在酿酒酵母中，DA由葡萄糖衍生的乙酰辅酶A通过脂肪酸合成酶（FAS）复合体的迭代延长产生。虽然在中链中间体形成过程中会短暂存在，但它们通常会被进一步延长为长链脂肪酸（C16–C18）或通过过氧化物酶体β-氧化降解。因此，细胞内的DA水平本身较低，成为下游ω-氧化向SA转化的主要瓶颈。在癸酸生物生产的背景下，DA的ω-氧化通过一个定义明确的三步末端氧化级联反应进行。首先，DA的末端甲基（ω-碳）被细胞色素P450单加氧酶羟基化生成10-羟基癸酸（10-HDA）。随后，10-HDA被醇脱氢酶氧化为10-氧代癸酸（10-ODA）。最后，ω-醛中间体进一步被醛脱氢酶氧化生成SA。因此，在酿酒酵母中重建这种DA到SA的氧化途径需要协调表达功能性P450单加氧酶系统以及下游脱氢酶来完成末端氧化级联反应。
尽管像C. tropicalis和Yarrowia lipolytica这样的油酵母已被用于基于ω-氧化的二羧酸（DCAs）生产，但这些方法都依赖于使用外源提供的脂肪酸或其衍生物的回收途径。例如，C. tropicalis通过补充脂肪酸或脂肪酸衍生物生产SA，过表达细胞色素P450单加氧酶及相关氧化还原酶实现了脂肪酸甲酯向己二酸（C6 DCA）的转化，并提高了ω-氧化效率（Min Lee等人，2024年）；组合途径工程和基因组规模建模方法已被应用于Y. lipolytica，通过重新定向细胞内脂肪酸代谢实现了从甘油生产长链DCAs（Abghari等人，2017年）。此外，Y. lipolytica还从外部添加的脂肪酸或相关衍生物中生产了其他脂肪族DCAs（Park等人，2023年）。然而，这些系统不支持从葡萄糖从头合成SA，目前尚未有报道在酿酒酵母中实现SA生产。
在这项研究中，我们通过整合异源ω-氧化途径和β-氧化阻断，在酿酒酵母中建立了从葡萄糖到SA的从头生物合成路线（图1）。具体来说，删除了六个参与脂肪酸降解的基因以防止脂肪酸分解并重新定向碳流。为了建立ω-氧化模块，我们表达了来自C. tropicalis的四个异源基因。为了进一步提高催化效率并分离产物生成与生长过程，我们在可诱导启动子系统下引入了多个拷贝的优化密码子的基因。据我们所知，这项工作代表了首次在酿酒酵母中直接从葡萄糖从头生产SA的实例。
菌株和培养条件
使用酿酒酵母 D452-2（MATα, leu2, his3, ura3, can1）作为SA生产的宿主菌株。编码ω-氧化途径的基因——细胞色素P450单加氧酶（CtCYP52B1、CTRG_03115）、细胞色素P450还原酶（CtNCP1、CTRG_00485）、醇脱氢酶（CtADH1、CTRG_06113）和醛脱氢酶（CtALD1、CTRG_04471）来自C. tropicalis MYA-3404（ATCC）。大肠杆菌 DH5α用于质粒构建和维护。本研究中使用的所有菌株均列在
通过多基因删除β-氧化途径将脂肪酸流向癸酸
在C. tropicalis中，可以通过使用DA作为前体进行ω-氧化来合成SA。因此，细胞内DA浓度是酿酒酵母中SA生产效率的关键决定因素。然而，由于其疏水尾部可以插入质膜，改变脂质排列并降低膜流动性，DA比大多数其他脂肪酸具有更高的细胞毒性，从而导致氧化应激（Borrull等人，2015年）。这些效应
结论
在这项研究中，我们通过系统性的途径重组和CRISPR-Cas9修饰，改造了酿酒酵母以实现从葡萄糖从头生产癸酸（SA）。删除六个脂肪酸降解基因后获得了6KO菌株，该菌株能够从20克/升的葡萄糖中积累28.9毫克的癸酸（DA）。引入来自Candida tropicalis的异源ω-氧化模块后，实现了初始SA产量（0.4毫克/升）。由于ω-碳氧化是限速步骤，多拷贝整合
未引用的参考文献
Han等人，2017年；Pereira等人，2019年，《癸酸市场规模、份额、增长与预测，2034年》。
CRediT作者贡献声明
王帅文：撰写——原始草稿、可视化、验证、研究。吴玉英：撰写——原始草稿、研究。池尚允：研究。尹恩珠：撰写——审阅与编辑、监督、概念化。金庆宪：撰写——审阅与编辑、监督、研究、资金获取、概念化。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了韩国国家研究基金会（NRF）的生物与医疗技术发展计划的支持，该计划由韩国政府（MSIT）资助（RS-2024-00452695），以及由韩国海洋与渔业部资助的韩国海洋科学技术促进院（KIMST）的支持（RS-2025-02304428）。S.W.还得到了中国留学基金委（CSC，资助编号<-->202106790013的支持。此外，韩国大学食品安全办公室也提供了额外支持
