通过空间共定位的双模块DNA支架，实现对亚群特异性细胞外囊泡中miRNAs的集成单管检测

《Biosensors and Bioelectronics》：Integrated single-tube detection of miRNAs in subpopulation-specific extracellular vesicles via spatially colocalized dual-module DNA scaffold

基于多价aptamer捕获与CRISPR/Cas12a信号放大的单管整合平台，实现了外泌体亚群特异性miRNA的高灵敏度检测。该平台通过DNA纳米结构同时完成外泌体亚群捕获和miRNA邻近识别，利用CHTA催化循环放大信号，检测限达1.42×104颗粒/μL。实验证明CD63+和MUC1+亚群携带的miR-21、miR-155表达存在显著异质性，其中MUC1+亚群诊断效能更优（AUC 0.83 vs 0.73）。该模块化平台为临床外泌体组学提供新策略。

　　

作者：任永安|杜旺超

中国陕西省科学技术大学化学与环境科学学院催化陕西省重点实验室，汉中市，723001

摘要

源自细胞外囊泡（EVs）的miRNAs是早期癌症诊断的宝贵非侵入性生物标志物。然而，目前大多数方法只能检测总EVs-miRNAs或来自单一亚群的miRNAs，忽略了亚群间的异质性。此外，EVs的分离和miRNA分析通常在不同的工作流程中进行，增加了样本处理难度并影响了重复性。在此，我们提出了一种集成的单管平台，用于亚群特异性的miRNA分析，该平台将基于多价适体的EVs捕获技术与CRISPR/Cas12a介导的信号放大技术结合在一个合理设计的DNA支架上。多价适体系统的捕获效率达到了84.3%，显著优于单价适体（56.4%）。当捕获的EVs亚群在原位裂解后，释放的miRNAs由于局部浓度增加而优先与相邻的识别探针结合，从而有效地启动了催化发夹组装（CHA）反应。由此产生的大量双链miRNAs随后激活了Cas12a，实现了低至1.42×10^4颗粒/μL的检测限（LOD）。该平台具有模块化设计，通过更换捕获适体可以轻松针对不同的EVs亚群进行重新配置。我们通过分析CD63^+和MUC1^+两个特定亚群中的miR-21和miR-155来展示了这一灵活性。结果揭示了这些亚群中的细胞系特异性表达模式以及CD63/MUC1捕获的EVs组分之间的显著异质性。同时，在临床诊断中，MUC1^+亚群的表现优于CD63^+亚群，miR-21（AUC值分别为0.85 vs 0.75）和miR-155（AUC值分别为0.83 vs 0.73）的AUC值也更高。总体而言，我们的研究强调了EVs亚群异质性在癌症诊断中的关键作用，并提供了更具信息量的生物标志物数据。

引言

细胞外囊泡（EVs）是由磷脂双层包裹的纳米颗粒，几乎所有类型的细胞都会分泌它们（Kalluri和LeBleu，2020）。它们起源于内吞途径，携带反映其母细胞特性的分子成分（如蛋白质、脂质和核酸）（Gurunathan等人，2019）。EVs独特的脂质膜结构有效保护了其携带的物质，使其能够在体液中稳定传递信息，并有助于调节多种生理和病理过程（Kalluri和LeBleu，2020）。在EVs携带的物质中，小型非编码RNA（miRNAs）作为典型的核酸成分（Drula等人，2020），已被证明参与肿瘤微环境的构建（Tan等人，2020）或通过转录后基因调控促进肿瘤转移（To等人，2024；Yan等人，2025）。随着肿瘤的发展，其miRNA表达谱会在释放的EVs中得到忠实再现，从而能够动态评估肿瘤状态（Chen等人，2024b）。为了利用这一潜力，建立一种能够灵敏量化癌症相关EV miRNAs的分析策略至关重要，同时要尽量减少样本损失和降低操作过程中的变异性。

EVs-miRNA检测的金标准是定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）（Jang等人，2024）。尽管qRT-PCR在miRNA检测方面具有较高的灵敏度，但它需要较大的样本量来分离足够的EVs。此外，其工作流程包括多个劳动密集型步骤，如EVs裂解、RNA提取、cDNA合成和精确的温度控制，这些步骤带来了实验挑战（Forero等人，2019）。近年来，出现了多种无需qRT-PCR的策略，旨在简化操作并提高稳定性（Liu等人，2020；Zhao等人，2020；Chen等人，2022，2024；Lai等人，2025）。这些策略可以根据其放大机制大致分为：酶辅助或无酶信号放大，以及无放大信号转导。例如，Lai等人（2025）开发的引物交换反应（PER）系统通过使用目标miRNA触发级联酶促反应来生成信号，实现了高灵敏度。为了进一步简化操作和降低成本，还开发了无酶放大平台。Chen等人构建了基于金纳米粒子的发夹探针（Chen等人，2024a），其中目标miRNA特异性地触发催化发夹组装（CHA）反应以生成可检测的信号。此外，Qi等人（2024）开发的电激活SERS纳米探针平台消除了放大反应，依赖于直接读数进行检测。总体而言，这些策略的发展为在复杂生物样本中高度灵敏地检测EVs-miRNAs奠定了坚实基础。

尽管取得了进展，但大多数现有策略仍存在两个根本性限制。首先，EVs的分离和EV-miRNAs的提取/检测是在不同的平台上进行的（Yang等人，2024；Zhou等人，2024）。跨平台操作需要重复样本处理，从而延长了操作时间，并增加了目标丢失（特别是对于低丰度miRNAs）、污染和批次间变异的风险。其次，目前的大多数研究主要集中在总EVs群体的miRNA含量上（Yan等人，2023；Kim等人，2025）。实际上，生物流体中的EVs具有高度异质性，由多个携带不同物质的亚群组成。与癌症相关的miRNA特征往往富集在特定亚群中，在整体分析中可能会被稀释或掩盖。因此，开发一个集成的EVs-miRNA分析平台至关重要。该平台可以同时捕获特定的EVs亚群并量化其携带的miRNAs，从而不仅提供更高的特异性，还提供更具临床相关性的生物标志物数据。

在这里，我们通过结合多价捕获技术和CRISPR/Cas12a放大技术，建立了一个集成的EVs-miRNA分析平台。该集成平台在一个反应系统中实现了EVs亚群的捕获、miRNA的邻近识别和信号放大（图1）。简而言之，我们利用杂交链反应（HCR）在磁珠（MBs）表面聚合长链DNA产物。这些DNA链上装饰有等间距的功能模块：适体（用于EVs亚群分离）和发夹探针（H3，用于miRNA识别）。完整的检测机制如下：首先，DNA支架在MBs表面提供了高密度的标记特异性适体，使EVs能够形成多次适体-标记结合事件。这种多价结合提高了整体亲和力，降低了有效解离率，从而实现了特定EVs亚群的稳定和选择性捕获。随后，加入含有另一种发夹探针（H4）的裂解缓冲液，在原位裂解EVs并释放miRNAs。释放的miRNAs随后触发催化发夹组装（CHA）循环：它通过脚手架介导的链置换打开相邻的H3，使H3序列与H4杂交形成含有Protospacer Adjacent Motif（PAM）的H3/H4双链。关键的是，miRNA被置换并回收，从而能够启动多轮H3-H4杂交并生成大量双链（Gong等人，2022）。通过磁分离去除多余的H4和EVs碎片以最小化背景激活后，CRISPR/Cas12a系统被H3/H4双链激活，通过Cas12a切割恢复了FAM-BHQ1标记的发夹底物的荧光，从而实现了目标EVs-miRNAs的检测。我们集成平台的优势在于直接检测通过裂解释放的miRNAs，这不仅消除了miRNA转移的需要，还利用了空间限制增加了局部有效浓度和碰撞频率，从而提高了检测灵敏度。利用该平台，我们设计了针对两个代表性EVs亚群（CD63^+和MUC1^+）以及两种胃癌相关miRNAs（miR-21和miR-155）的探针。该平台揭示了不同细胞来源和EVs亚群中EVs-miRNA表达的异质性。关键的是，即使在来自同一细胞系的不同亚群之间，也观察到了差异化的miRNA表达谱。这些发现强调了在EVs-miRNA研究中区分EVs亚群的必要性。此外，结果还显示了EVs亚群特异性miRNA谱在临床样本中的不同诊断性能。总体而言，我们介绍了一种用于亚群特异性miRNA分析的单管平台。该平台不仅减少了miRNA转移步骤，还允许快速针对不同的EVs亚群和miRNA目标进行重新配置。这种集成能力实现了亚群水平的诊断特异性，并从临床样本中获得了更具生物学信息量的数据。

实验部分

本研究中使用的寡核苷酸序列是根据先前的研究设计的，详见表S1。适体序列来自之前的文献：MUC1（Kd = 0.135 nM）（Ferreira等人，2006）和CD63（Kd = 17.1 nM）（Li等人，2022）。实验程序及其详细信息，包括试剂、EVs的分离和表征（超速离心、透射电子显微镜和Western blotting）、构建和表征等

集成平台的构建和表征

为了高效捕获特定的EVs亚群并邻近检测其携带的miRNAs，需要精确的纳米工程结构和识别元件。DNA纳米结构（Wu等人，2021；Qin等人，2025）（例如DNA四面体、DNA折纸框架和DNA纳米线）与功能性核酸（Liu等人，2024；Wu等人，2025）（例如适体、DNA酶、分子信标）的结合，是构建此类平台的理想候选者，因为它们

集成平台总结及关键发现

我们开发了一个集成平台，能够捕获特定的EVs亚群并邻近检测其携带的miRNAs。该平台利用延长DNA链上的多价适体进行高效捕获，而邻近检测则增强了miRNAs的局部反应浓度。此外，所有反应步骤都在一个管子内完成，最大限度地减少了miRNAs的损失。这些优势使我们的平台优于传统的分离工作流程。

注释

作者声明没有竞争性财务利益。

CRediT作者贡献声明

任永安：数据管理、研究、方法学、资源、监督、初稿撰写、审稿与编辑。杜旺超：研究、方法学。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了陕西省科技创新团队项目（2025RS-CXTD-040）的支持。