一种双功能DNA多价结构，能够稳定捕获尿路上皮癌细胞，并结合CRISPR/Cas12a信号放大技术，用于膀胱癌的检测

《Biosensors and Bioelectronics》：Bifunctional DNA multivalent structure integrating stable capture of urothelial carcinoma cells with CRISPR/Cas12a signal amplification for bladder cancer detection

非侵入性膀胱癌尿液检测中，机械扰动易导致单价aptamer结合不稳定。本研究通过杂交链反应构建线性多价DNA纳米结构（MAP12），集成多价aptamer识别与CRISPR/Cas12a信号放大系统，显著提升细胞结合稳定性和信号灵敏度（LOD达1.1 cells/mL），临床样本检测显示92%灵敏度、88%特异性和AUC 0.9424，实现荧光与侧流双读数检测。

　　

孙晓飞|钱磊|金迪|郭斌|陶珊|方佳萌|王少鹏|陈海格|田甜|雷浩志

上海交通大学医学院仁济医院泌尿科分子医学研究所（IMM），上海核酸化学与纳米医学重点实验室，中国上海200127

摘要

由于现有基于尿液的检测方法在实际检测条件下的分析性能有限，非侵入性检测膀胱癌仍然具有挑战性。在这里，我们报道了一种线性可编程DNA纳米结构，它结合了多价适配体识别和CRISPR/Cas12a信号转导技术，用于检测肿瘤来源的尿液脱落细胞。这种多价支架通过杂交链反应组装而成，在机械扰动的检测过程中能够增强配体-细胞结合的稳定性，从而支持机械稳定的生物识别，并使细胞结合亲和力比单价适配体提高约14倍。优化后的结构（MAP₁₂）在模型系统中可实现1.1个细胞/毫升的检测限（LOD），并在临床尿液样本中表现出高诊断性能（灵敏度92%，特异性88%；AUC=0.9424），支持通过荧光和侧向流动装置（LFD）进行双重信号读取。这项工作建立了一种DNA纳米结构策略，可在实际操作条件下实现可靠、快速且非侵入性的癌细胞检测。

引言

膀胱癌是一种常见的恶性肿瘤，具有高发病率和显著的复发风险，因此早期检测和持续监测对于改善治疗效果至关重要（Calvet等人，2025；van Hoogstraten等人，2023；Wagle等人，2025）。传统的诊断和监测方法主要依赖于膀胱镜检查，这是一种侵入性且成本高昂的程序，不适合频繁进行（Leyderman等人，2025；Wen等人，2025）。因此，基于尿液的液体活检作为一种有吸引力的非侵入性替代方法应运而生，因为尿液可以直接接触尿路上皮（Alfred等人，2024；Siegel等人，2025）。尽管有这一优势，基于尿液的检测方法的临床应用仍然有限（O'Leary，2025；Shkolyar等人，2025）。现有的方法，包括尿液细胞学和尿液衍生生物标志物的分子分析，通常存在灵敏度不足、依赖操作者或工作流程复杂耗时的问题（Gontero等人，2024；Lindskrog等人，2025）。此外，许多基于尿液的检测策略在常规样本处理和操作过程中（如清洗、分离和液体操作）表现出性能下降（Jang等人，2026；O'Leary，2025）。这些步骤引入的机械扰动可能会破坏生物分子识别事件（Chen Y.等人，2025；Lawrence等人，2023），突显了基于尿液的液体活检在概念上的优势与其在实际操作条件下的可靠应用之间的关键差距。

在膀胱癌中，与疾病检测相关的尿液脱落细胞主要来自膀胱尿路上皮（O'Leary，2025）。其中包含尿路上皮癌细胞（UCCs），它们直接脱落进入尿液并保留肿瘤相关的细胞和分子特征（Maas等人，2023）。与血液中的循环肿瘤细胞（CTCs）相比，后者极为罕见且嵌入在复杂的生物环境中（Ou等人，2025；Wu等人，2021；Xia等人，2021；Zhang K.等人，2025），UCCs通常数量更多且存在于相对简单的基质中，使得尿液成为基于细胞的液体活检的理想介质（Ma K.等人，2026；Ma等人，2024；Zniber等人，2023）。然而，在实践中可靠地识别和捕获UCCs仍然具有挑战性。在尿液处理过程中，配体-细胞相互作用不断受到清洗和分离步骤产生的流体剪切力的影响，这可能会破坏非共价结合事件（Dong等人，2020；Song P.等人，2017；Xu等人，2025）。这一限制对于单价识别配体尤为明显，因为它们的瞬时相互作用在机械扰动的检测条件下容易解离，最终导致细胞丢失和分析灵敏度降低（He Y.等人，2024b；Li Z.等人，2018；Song Y.等人，2019）。为了克服这些限制，已经探索了多种识别策略，包括多价适配体（Chen Y.等人，2025；Du等人，2026；Figg等人，2020；Li Y.等人，2025）：然而，过度的设计复杂性、有限的价态和刚性结构仍然是实现检测过程中清洗引起的机械扰动下稳定配体-细胞相互作用的挑战。

杂交链反应（HCR）是一种等温的、无酶的DNA自组装策略，广泛应用于生物传感（Dirks和Pierce，2004）。两条亚稳态的发夹链保持惰性状态，直到触发链开始交替杂交，形成长的、带切口的DNA纳米线（Dirks和Pierce，2004）。这些结构的平均长度与启动剂浓度成反比，从而实现定量信号输出（Gao等人，2020；Guo B.等人，2024）。HCR的可编程性和模块化特性允许在DNA支架上精确定位功能元件，使其非常适合构建可定制的传感架构（Shi等人，2020）。适配体是通过SELEX选出的短单链核酸，具有高亲和力、特异性、化学稳定性和易于合成（Ellington和Szostak，1990；Tuerk和Gold，1990）。当适配体以多价形式排列在HCR支架上时，可以增加局部配体密度并增强目标结合（Liu等人，2020）。然而，许多基于HCR的系统依赖于复杂的标记或多步骤报告，增加了背景信号和操作复杂性（Bi等人，2017）。CRISPR/Cas12a系统提供了一种补充的信号放大机制（Yamano等人，2016）。在识别出含有适当原间隔序列（PAM）的目标后，Cas12a激活其转切割活性并切割附近的单链报告分子，实现敏感的等温检测（Pickar-Oliver和Gersbach，2019）。将HCR支架与Cas12a基序整合在一起，可以在单一DNA纳米架构内实现目标结合和信号放大，提供了一种简化、可靠且实用的生物传感策略。先前的研究尝试将多价适配体与CRISPR/Cas12a系统结合用于癌细胞检测，包括表面固定（Lv等人，2021）、滚环扩增（RCA）（Guo H.等人，2025；Wang等人，2022）和DNA纳米结构（Chen Y.等人，2025）以及HCR组装，但还需要进一步探索对适配体/PAM排列、价态、结合亲和力和结合稳定性的精确控制。

在这里，我们报道了一种可编程的线性DNA纳米结构，它结合了多价适配体介导的识别和CRISPR/Cas12a信号转导技术，用于可靠地检测肿瘤来源的尿液脱落细胞（图1）。基于HCR，我们设计了一种简单的线性多价DNA支架，可以实现具有定义好的价态和空间组织的识别配体的可编程组装。这种线性架构不仅提高了适配体的价态，还为适配体-细胞相互作用提供了空间自由度，有利于高效的多价识别。适配体Sgc8最初是通过基于肿瘤细胞的SELEX筛选出来的（Shangguan等人，2006），对PTK7具有高亲和力和特异性（Shangguan等人，2008），并广泛用于检测血液肿瘤细胞（Chang等人，2019；Gao等人，2020；He A.等人，2024a）。进一步的临床研究表明，放射性标记的Sgc8能够实现膀胱癌的PET成像，支持其对膀胱肿瘤细胞的有效识别（Ding等人，2026）。Sgc8被整合到支架中以介导细胞结合，而PAM序列则周期性嵌入其中，以实现稳定的目标识别和Cas12a激活。通过系统优化配体价态，确定了一种最佳结构（MAP₁₂）。该结构显著提高了配体-细胞结合亲和力，并在检测过程中清洗引起的机械扰动下提高了稳定性，从而在实际检测工作流程中支持机械稳定的配体-细胞识别。同时，支架内的重复PAM元素实现了高效的Cas12a介导的信号放大，使得分子识别和信号转导能够在单一DNA构建中结构上集成。因此，这种策略能够在快速简化的操作流程中实现尿液中UCCs的敏感可靠检测，并支持通过荧光和侧向流动装置（LFD）进行双重信号读取。总体而言，这项工作建立了一种DNA纳米结构策略，解决了当前基于尿液的检测方法的关键机械和结构限制，具有很强的非侵入性膀胱癌诊断和监测潜力。

材料

所有DNA和crRNA链均由Sangon Biotech有限公司（中国上海）合成，具体信息见补充文件中的表S1。这些核酸序列是根据本研究的目标对先前报道的序列进行了修改（Dirks和Pierce，2004；Shangguan等人，2006；Yamano等人，2016）。使用六水合氯化镁（MgCl₂·6H₂O）、50×TAE缓冲液、4S Gelred核酸染料、CRISPR测试条（LFD）、琼脂糖、Streptavidin磁珠（1微米）等。

MAP_x

基于先前的研究和设计改进（Chen P.等人，2022；Dirks和Pierce，2004；Lei等人，2025），我们构建了一种线性MAP_x，它结合了多价识别能力和多价CRISPR/Cas12a激活PAM模块（图1a和表S1）。MAP_x的核心框架由三个单链DNA组分组成，包括结构启动链D和两个延伸链（HM1和HM2），这些组分进一步用Sgc8适配体进行了功能化。

结论

在这项研究中，我们开发了一种可编程的MAP_x系统，用于快速和非侵入性地检测UCCs。该系统结合了多价肿瘤细胞识别和CRISPR/Cas12a信号放大，并通过基于HCR的组装将Sgc8适配体和多个PAM基序组装成具有可调价态的线性DNA架构。线性架构不仅提高了适配体的价态，还为适配体-细胞相互作用提供了空间自由度，有助于提高多价识别效果。

CRediT作者贡献声明

孙晓飞：数据整理、正式分析、研究、撰写——原始草稿。钱磊：数据整理、方法学、资源获取。金迪：数据整理、资金获取、方法学、资源获取。郭斌：数据整理、可视化。陶珊：数据整理、可视化。方佳萌：数据整理、可视化。王少鹏：资金获取、方法学。陈海格：资金获取、资源获取、监督。田甜：概念化、方法学、监督、验证。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（82002241、32471425、32301158、82173076、82573737）、国家重点研发计划（2024YFA0916704）以及上海核酸化学与纳米医学重点实验室临床加杰出项目（2025ZYB005、2025ZYC012）的支持。