《Insect Biochemistry and Molecular Biology》：Functional characterization of a previously unknown gene governing metamorphosis in Bombyx mori
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昆虫幼虫到蛹的变态过程涉及复杂基因调控，新基因Lptf通过影响剪接体相关通路调控变态发育和丝腺功能。
陶路|邢志平|董慧东|邓玉平|李志鹏|韩高|刘晓静|胡波|谭安江
江苏省科技大学生物技术学院蚕桑与动物生物技术重点实验室，中国镇江212100
摘要：
昆虫变态是一个高度复杂的生物过程，尤其是在从幼虫到蛹的转变过程中，涉及多个基因和途径的精确和协调调控。然而，这一过程中许多关键基因的功能和调控机制仍不甚明了。在本研究中，我们在家蚕（Bombyx mori）中鉴定出一个先前未被描述的基因Lptf。组织表达分析显示，该基因在多种组织中广泛表达。利用二元转基因CRISPR/Cas9系统生成了Lptf突变体。Lptf的缺失导致幼虫体型显著减小，三酰甘油（TAG）含量降低。此外，Lptf的缺失还阻碍了幼虫向蛹的变态过程，并影响了丝腺的发育和丝蛋白的分泌。RNA-seq和qRT-PCR分析表明，Lptf的突变导致20-羟基蜕皮激素响应基因和丝蛋白基因的表达显著下调。KEGG通路富集分析显示剪接体通路显著富集，GO富集分析显示RNA加工通路也显著富集，这表明RNA剪接和加工过程受到了显著影响。这些发现不仅揭示了一个参与变态过程的先前未知基因，还为进一步解析昆虫变态的基因调控网络提供了重要线索。
引言
真核生物mRNA的成熟依赖于剪接体，这是一种由小核核糖核蛋白颗粒（snRNPs）等成分组成的复合体，它催化前mRNA中内含子的去除以完成剪接过程（Matera和Wang，2014）。核心剪接体主要由五种含有不同小核RNA（snRNAs）的snRNPs和近一百种蛋白质组成（Kastner等人，2019）。其中，七种保守的Sm蛋白质（SmD1、D2、F、E、G、D3和B）形成一个环状结构，该结构与U1、U2、U4和U5 snRNAs的Sm结合位点结合（Bringmann和Lührmann，1986）。相比之下，U6 snRNA与另一个由七种同源的Sm样蛋白质（Lsm2-8）组成的环状结构相关联（Zhou等人，2013）。在U7 snRNP环中，SmD1和SmD2被Lsm10和Lsm11取代（Sabath等人，2013；Schümperli和Pillai，2004）。这些由snRNA和Sm/Lsm蛋白质形成的复合体被称为核心snRNPs。snRNPs的组装还依赖于一系列分子伴侣蛋白，主要包括Survival Motor Neuron（SMN）复合体（包含SMN、GEMIN（2-8）和Unr-interacting protein（UNRIP）（Battle等人，2006；Pellizzoni等人，2002；Will和Lührmann，2001），以及精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）复合体（包含PRMT5、WD45和pICln）（Chari等人，2008）。这些分子伴侣蛋白依次与snRNA和Sm/Lsm蛋白质结合和分离，动态调节snRNPs的生物合成（Matera和Wang，2014）。
剪接是基因表达中的关键调控步骤，其功能障碍常常导致严重的发育或疾病表型。例如，SmE的突变可导致人类出现少毛症11型，表现为头皮和体毛稀疏（Pan等人，2021）。SmB的突变与脑-胸-下颌综合征（CCMS）的发病机制相关，其特征是肋骨后缘缺损和Pierre Robin序列（Lynch等人，2014）。SMN1的缺失会导致脊髓性肌萎缩症（SMA），这是婴儿最常见的遗传性死亡原因之一（Lefebvre等人，1995）。在小鼠中，GEMIN2、GEMIN3或GEMIN4的敲除会导致早期胚胎死亡（Jablonka等人，2002；Meier等人，2018；Mouillet等人，2008）。在Drosophila中，SmD1的完全突变会导致幼虫死亡，而某些纯合突变体可以存活超过正常寿命（Gonsalvez等人，2008）。SmD3的缺失会导致胚胎死亡，其下调会导致组织过度生长（Schenkel等人，2002）。Lsm10/Lsm11的缺失会阻止个体达到成年期，在非蛹化幼虫阶段导致死亡（Godfrey等人，2009）。GEMIN5的缺失会在蛹期导致完全死亡、寿命缩短和运动障碍（Kour等人，2021）。在蚕中，BmPRMT5功能的丧失会导致雄性和雌性不育（Copenhaver等人，2023）。这些研究突显了剪接机制在发育中的保守和关键作用。
在昆虫中，生长和变态通常被认为是由蜕皮激素和幼虫激素（JH）调节的，这两种激素分别由前胸腺（PG）和侧体腺（CA）分泌。在JH存在的情况下，20-羟基蜕皮激素（20E）会诱导幼虫蜕皮；而在JH缺失的情况下，20E会触发幼虫向蛹和蛹向成虫的变态（Riddiford，1994）。20E调节幼虫向蛹转变的分子机制已经得到了很好的阐明。20E与由蜕皮激素受体（EcR）和ultraspiracle（USP）组成的异二聚体复合物结合，该复合物直接激活早期蜕皮激素诱导基因（如E74、E75和Broad复合体（BR-C）的转录。这些早期蜕皮激素诱导基因随后调节大量晚期蜕皮激素诱导基因（Dubrovsky，2005）。例如，在Leptinotarsa decemlineata中，EcR的敲低会导致幼虫向蛹和蛹向成虫的蜕皮失败（Xu等人，2020a）。在Blattella germanica中，最终幼虫龄期HR4的缺失会导致幼虫死亡并阻止蛹化（Xu等人，2018b）。已有研究表明，Bombyx mori中有多种基因参与幼虫向蛹的变态调节。例如，E93通过调节20E信号通路来促进幼虫向蛹的变态（Liu等人，2015）。Schlank通过表观遗传方式将Hairy位点的H3K27ac转换为H3K27me3来调控幼虫向蛹的转变（Yuan等人，2024）。然而，在B.mori中，调控幼虫向蛹变态的基因仍大部分未知。
在昆虫中，共表达网络分析已被广泛用于识别与发育调节（Zhang等人，2017）、环境应激反应（Xu等人，2021）和杀虫剂抗性机制（Tian等人，2021）相关的新基因。例如，在蚕中，基于从包括丝腺在内的多个组织获得的RNA-seq数据进行了共表达网络分析，以识别参与丝蛋白合成的新调控因子（Masuoka等人，2022）。
在这项研究中，我们使用鳞翅目模式昆虫B.mori，系统分析了参与snRNP组装的基因的共表达谱，并鉴定出一个先前未被描述的基因Lptf，该基因与Sm/Lsm蛋白质有强烈的共表达。利用 clustered regularly interspaced small palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9（CRISPR/Cas9）系统敲除Lptf后，发现幼虫体型减小、蛹化缺陷以及丝腺发育异常。RNA-seq和qRT-PCR分析表明，该基因可能影响剪接体通路的稳态，从而调节包括激素信号通路和丝腺发育程序在内的关键生物过程。总体而言，这项研究鉴定出一个功能上尚未被描述的基因，该基因在蚕幼虫生长和变态中起着关键作用，可能成为控制鳞翅目害虫的潜在靶点。
部分摘录
蚕品系
实验中使用的蚕品系是多化性、不滞育的Nistari品系。幼虫在25°C和60%相对湿度的标准条件下以新鲜桑叶为食（Xing等人，2025）。
结合组织表达数据的共表达网络分析和系统发育分析
为了识别B.mori中可能与剪接相关的基因，我们从SilkDB 3.0中检索了Sm/Lsm蛋白质的共表达数据。以PCC ≥ 0.95作为阈值，选择了表现出强共表达的基因。在这些基因中，有七种Sm/Lsm蛋白质具有符合此标准的共表达基因，并对其共表达基因集进行了文氏图分析。结果显示，有一个基因与六种Sm/Lsm蛋白质有强烈的共表达（图1A）。
讨论
昆虫变态，特别是从幼虫到蛹的转变，涉及大量基因的协调调控，其中许多基因的功能仍不清楚。在这项研究中，我们鉴定出一个先前未被描述的基因Lptf，该基因调节蚕的幼虫向蛹的变态过程。CRISPR/Cas9介导的敲除实验表明，Lptf对家蚕（B. mori）的正常幼虫生长和发育、幼虫向蛹的转变以及丝腺的功能至关重要
CRediT作者贡献声明
董慧东：方法学、研究、数据管理。邓玉平：方法学、研究、数据管理。陶路：写作——审稿与编辑、初稿撰写、可视化、方法学、研究、数据管理、概念化。邢志平：方法学、研究、数据管理。胡波：写作——审稿与编辑、初稿撰写、监督、项目管理、方法学、资金获取、数据管理、概念化。谭安江：
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（32573304和32572828）的支持。
